王新天，王卫斌，陈升位，贺军与，朱思德，莫 凡，余 其，张婷婷，李玉平

(云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201)

在长期的进化过程中，大麦形成了特有的穗发育模式，即穗轴无分枝、每个穗轴节上着生1个三联小穗[1]。通过自然[2-3]和人工诱变[4-5]可改变大麦的穗发育模式，获得穗分枝突变体。目前，已报道了多种穗发育突变体，如茎分枝、复小穗和支穗等多种突变体[2-6]，其中，穗分枝大麦突变体4个，即Foma突变体[3]、 Prbs突变体[4]、F151突变体[2]和Ynbs突变体[5]，这些突变体均可稳定遗传[2-3,5,8-9]。Larsson 等[7]发现，Foma突变体的穗分枝性状受1对隐性核基因控制，该基因与小穗轴短毛基因(s)连锁，位于7H 染色体。黄碧云等[7-9]通过 Prbs突变体与蒲大麦2号等品种杂交后代的遗传分析，发现该突变体的穗分枝性状受1对隐性核基因(Prbs)控制，并将其定位在3H染色体短臂的2个SSR标记HvLTPPB和Bmag0508A之间[8-10]。冯宗云等[2]研究发现，F151突变体的穗分枝性状也受1对隐性核基因控制，并将其定位在4H染色体短臂的SSR标记HVM40和RFLP标记CDO669之间，该基因与标记位点分别相距8.7 cM和5.8 cM。虽然大多数报道认为大麦穗分枝遗传受1对隐性核基因控制，但黄碧光等[9]认为， Prbs突变体的穗分枝性状遗传可能受主基因和微效多基因控制。

大麦穗分枝突变体的多联(或三联)小穗和单花小穗增多，但结实率却普遍下降[2-5]。有报道表明，Vsr类基因控制大麦三联小穗的侧小穗育性[11-18]，其中，Vsr1基因位于2H 染色体长臂，该基因突变后大麦三联小穗中的侧小穗可育[16,18]，但其表达受Int-c基因编码的转录因子调控[19-21]。除Vrs1外，大麦1H、3H 和5H 染色体还分别携带有三联小穗中单花小穗育性的基因Vrs2[15]、Vrs3[11,14]和Vrs4[12]。虽然Int-c基因可调控Vsr1基因并控制单花小穗育性，但不影响Vrs2、Vrs3和Vrs4基因的遗传效应[19,21]。尚 毅等[12]发现， Prbs 突变体的穗分枝发育起始于二棱期末，在三联小穗原基基部可看到明显的穗分枝原基，且其分化与单花小穗等花器官的发育形成关联。虽然少有穗分枝基因与Int类和Vsr类基因互作的报道，但从形态结构看，大麦二棱穗、六棱穗和穗分枝都具有相似的主穗轴结构和各种花器结构。推测大麦分枝穗和单花小穗等穗部性状的发育遗传基因可能存在某种调控关系。

与Foma等3个突变体相比，Ynbs突变体具有较多的穗分枝以及小穗退化、单穗小花增多和结实率下降等典型特性[5]。王家曦等[22]分析了不同Ynbs株系的穗部特性差异及其穗分枝与小穗退化、单穗小花数和结实率等穗部特性的关联性，但有关Ynbs突变体穗分枝性状遗传方面的研究还未见报道。本研究拟通过对Ynbs-1突变体及其重组自交系(正常六棱穗)等材料的正、反杂交F1植株的穗分枝特性观测，分析F2及其F3群体中正常穗与分枝穗植株的分离状况，对已报道的穗分枝基因连锁SSR标记和小穗轴短毛标记进行检测，解析Ynbs-1株系的穗分枝遗传特性，为基于 Ynbs-1株系大麦穗分枝等性状的遗传机制研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包括穗分枝突变体(Ynbs-1)、重组自交系(RIL-1)、北青7号、保大麦8号和多棱穗分枝大麦(表1)，Ynbs-1分别与RIL-1(正、反交)、保大麦8号和多棱穗分枝大麦(Prbs)的杂交F1、F2或F3群体。Ynbs-1和RIL-1均为北青7号成熟种子EMS诱变的1个M1植株的自交后代，由本课题组创制并保存，北青7号和保大麦8号分别由迪庆州农业科学研究所、保山市农业科学研究所提供，Prbs由浙江省农业科学院国家大麦改良中心提供，其中保大麦8号是云南省多年主推六棱大麦品种。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的种植和繁育

2015年11月8日种植 Ynbs-1等5份材料、以及 Ynbs-1与RIL-1(正、反交)、BDM-8和Prbs的杂交F1植株；在开花前，分别随机选取10株 Ynbs-1、RIL-1、BDM-8、 Prbs及 Ynbs-1分别与RIL-1和BMD-8杂交组合的全部F1植株套袋自交，在黄熟期采收种子。2016年11月13日种植Ynbs等5份试验材料及RIL-1、BDM-8和 Prbs的杂交F2群体，10行F2材料间种植1行杂交亲本和BQ-7(对照)；在开花前，随机选取10株 Ynbs-1、RIL-1、BDM-8、 Prbs及 Ynbs-1分别与RIL-1和BMD-8杂交组合的全部F2植株套袋自交，在黄熟期采收种子。2017年11月11日种植 Ynbs-1、RIL-1、BDM-8、 Prbs及 Ynbs-1分别与RIL-1和BMD-8杂交组合的全部F3株系。所有材料均采用完全随机排列，试验地点均为云南农业大学昆明北市区教学实验农场，株、行距分别5 cm和20 cm，其他田间管理措施同当地大麦常规栽培。

表1 5份试验材料Table 1 Five materials used in the study

1.2.2 穗分枝特性和穗轴毛调查

在花后7 d，随机选取 Ynbs-1和RIL-1的5个单株，用镊子剥去穗子中的籽粒、芒和颖壳等组织，使穗轴和分枝穗完全裸露；调查分枝穗数、分枝穗长度和分枝穗轴节数。借助Deli手持放大镜(辅助镜、6倍)观察小穗轴毛及其长度。

1.2.3 基因组DNA的提取和检测

花后7 d，分别随机选取 Ynbs-1、RIL-1及其杂交F2群体的分枝穗和正常穗的20个单株幼嫩叶片，采用CTAB法提基因组DNA，采用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度、完整性和纯度。

1.2.4 SSR标记的扩增和检测

用1.2.3中基因组DNA分别构建两个杂交亲本、F2群体分枝穗和正常穗的基因池。利用已报道的与穗分枝基因连锁的3对SSR标记引物(表2)扩增所构建的4个基因池的基因组。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR扩增条件和程序均参照冯宗云等[2,9-10]方法，采用8%的聚苯稀酰胺凝胶电泳检测扩增片段。

1.2.5 数据分析

采用下列公式分别计算F2(公式1)和F3(公式2)群体中分枝穗和正常穗植株(株系)观察频率的χ2值。

(1)

(2)

在公式中，Oi表示不同类型植株的观测频率，Ei表示不同穗型植株的理论频率。

采用SPSS 19.0中的单因素分析模块分析材料间农艺性状表型差异。

2 结果与分析

2.1 Ynbs-1的穗分枝特性

由图1可见， Ynbs-1的穗轴结构与RIL-1的具有明显差异，RIL-1无分枝穗(图1A、E)、 Ynbs-1具有数目不等的分枝穗(图1B、F)。Ynbs-1的穗分枝长度、穗分枝数和分枝穗轴节数平均值分别为1.48±0.09 cm、23.56±1.52个和1.32±0.63个，均极显著高于RIL-1的(P<0.01)。 Ynbs-1穗轴底部和顶部穗轴节上的分枝较短，大多只有1个分枝穗节，但中部分枝穗较长，大多具有3～5个分枝穗轴节(图1F)。由于穗分枝有差异， Ynbs-1和RIL-1的小穗结构也存在差异，其中RIL-1具有典型的三联小穗(图1C)， Ynbs-1具有不规则多联小穗(图1D)。

表2 3个SSR标记的引物Table 2 Primers of three SSR markers linked to the genes controllong spike branch tested

2.2 穗分枝基因的质核属性和显隐性分析

观察穗分枝突变体 Ynbs-1与RIL-1的正、反杂交F1植株的穗型和穗轴结构，发现F1植株均为正常穗，穗轴无分枝，三联小穗均着生在主穗轴节上(图2C、D)，表明控制 Ynbs-1突变体分枝穗遗传的基因属隐性核基因，分枝穗遗传不受细胞质基因影响。

利用 Ynbs-1突变体分别与RIL-1和BDM-8杂交，通过F1单株套袋自交创制2个杂交F2群体。2个杂交F2群体均只有分枝穗和正常穗2种个体。χ2检测结果表明，2种穗型的个体数比例均符合1∶3的分离比例(表3)，说明 Ynbs-1突变体的穗分枝性状受1对隐性基因控制。为了验证此观点，本研究将2个杂交组合的F2单株分别套袋自交，创制F3株系。在2个杂交组合的F3株系中，由穗分枝F2单株自交产生的F3株系均未发生性状分离，各株系的单株均为分枝穗。由正常穗F2单株自交产生的部分F3株系出现了正常穗和分枝穗，出现性状分离的F3株系为329个，其余160个株系性状不分离，χ2检测结果表明3种株系的数目之比符合1∶2∶1。

A和B、C和D、E和F分别为 Ynbs-1和RIL-1的穗型、小穗、穗轴。

A and B,C and D,F and E show the spike,spikelet,rachis of Ynbs-1 and RIL-1,respectively.

图1 试验材料 Ynbs-1 和RIL-1 的穗部特性

Fig.1 Spike characteristics of experimental materials Ynbs-1 and RIL-1

2.3 穗分枝基因的等位性检测

Ynbs-1(母本、图3A)与 Prbs(图3B)的杂交F1单株的穗轴均不分枝、穗轴节上着生三联小穗(图3C、D)。利用与穗分枝基因pbrs和bs(F151突变体的穗分枝基因)连锁的3个SSR标记(HVM40、Bmag0023和Bmag0508A)分别扩增Ynbs-1、RLI-1及其杂交F2群体分枝穗、正常穗植株的基因池DNA，发现3对引物在4个基因池中的扩增片段均无明显的长度差异(图4)。Ynbs-1和RIL的小穗轴毛均属短毛(接近无毛)型，且小穗轴毛长度没有明显差异(图1E、F)。Ynbs-1的穗分枝基因与3个SSR标记和穗轴毛基因不连锁，表明在3个SSR标记和穗轴毛基因的连锁基因组区域不存在控制Ynbs-1穗分枝的基因，即Ynbs-1携带的穗分枝基因与 Prbs、F151和Foma突变体携带的不等位。

A、B、C和D分别为Ynbs-1突变体、重组自交系及其F1植株的穗型和小穗。

A,B,C and D show the spike and spikelets of Ynbs-1,RIL-1 and the plant of F1population from direct and reciprocal crosses between the two materials,respectively.

图2 Ynbs-1、RIL-1及其正、反交F1植株的穗部特性

A、B、C、D：Ynbs-1、Prbs及其杂交F1植株的穗型和穗轴。

A，B，C，D：Spike of Ynbs-1，Prbs and the spike type and rachis of their F1.

图3 Ynbs-1与Prbs及其杂交F1植株的穗部特性

Fig.3 Spike characteristics of Ynbs-1,Prbs and F1plant from the hybrid between Ynbs-1 and Prbs

M：Marker；1、14：水；2～5、6～9、10～13：Bmag0508V、HCM40和Bmag0023在Ynbs-1/RIL-1及其杂交F2群体正常穗和分枝穗植株的扩增片段。

M:Marker; 1 and 14:Water; 2-5,6-9 and 10-13:Fragments amplified from 4 gene pool of Ynbs-1，Prbs and F2plants with branc hed spike and normal spike byBmag0508V,HCM40andBmag0023,respectively.

图4 在4个基因池中扩增的3个SSR标记

Fig.4 SSR markers amplified from the four gene pools

3 讨 论

黄碧光等[4]发现， Prbs的分枝穗着生在中部1～3个穗轴节上，具有1～3个分枝穗轴节。冯宗云等[2]发现，F151的分枝穗着生在中部1～2个穗轴节上，具有1～2个分枝穗轴节。与 Prbs等穗分枝突变体相比，本研究发现，Ynbs-1的分枝穗长度、分枝穗数和分枝穗轴节数的均值分别达到了1.48±0.09 cm、23.56±1.52个和1.32±0.63个，分枝穗长度变化不大，但其大多数主穗轴节上都着生有分枝穗、具有分枝穗较多的特性。

冯宗云等[2,9]利用F2群体单株突变性状与野生型性状的分离比、结合F3株系的性状分离特性，证明了控制F151、 Prbs的穗分枝性状受1对核基因控制。通过对正、反杂交F1及其F2、F3群体的穗分枝遗传分析，本研究发现，Ynbs-1突变体的穗分枝性状受1对隐性核基因控制，该结果与冯宗云等[2,9]的报道基本一致。

与 Prbs和F151相比，Ynbs-1株系具有明显不同的穗部特性，如小穗退化、单花小穗增多和结实率下降[3-5]、以及分枝穗较多等( 图1F)。但上述差异特性不能有效证明Ynbs-1株系的穗分枝基因与 Prbs等突变体的是否等位。利用矮128突变体与不同的小麦矮杆突变体杂交， 通过F1植株株高分析和杂交亲本间SSR标记的连锁分析，张祥池等[24]发现矮128突变体携带的矮杆基因与Rht8、Rht9和Rht13等矮杆基因不等位。 本研究通过Ynbs-1与 Prbs的杂交F1植株的穗分枝特性分析、结合3个SSR标记和穗轴毛标记在杂交亲本等材料间的连锁分析，证明了Ynbs-1株系的穗分枝基因与 Prbs等3个突变体的不等位，是一个新的穗分枝基因。

到目前为止，大麦幼穗发育遗传相关研究大多以三联小穗育性为主，并涉及控制三联小穗中单花小穗育性的一些基因及其功能[11-17,20-21]，但大麦三联小穗发育的遗传机制还有待深入研究。尚 毅等[10]和彭 澎等[25]发现， Prbs、Ynbs株系(包括Ynbs-1)的穗分枝原基分化与三联小穗等大麦花器原基分化相关联，且Prbs与Vrs1可能是等位基因[23]。沈真辉等[5]发现，Ynbs株系的穗分枝与多联小穗退化、单花小穗增多和结实率下降等特性具有关联性。本研究发现了Ynbs-1株系穗分枝基因数目、显隐性和质核属性等基本特性，该结果有助于深入研究Ynbs突变体的分枝穗、多联小穗退化和单花小穗育性等性状的遗传机制。