王丹　辛力　张静　杨娟侠　翟浩　董成虎

摘    要：为明确山东泰安本地蓝莓采后果实灰霉病及肉桂精油对其的抑菌效果，本研究从自然发病的蓝莓果实上分离菌株，采用传统真菌形态学、rDNA-ITS 序列分析，结合构建系统进化发育树进行鉴定，并通过体外熏蒸抑菌试验研究肉桂精油的抑菌效果。结果表明，该病原菌为灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。肉桂皮精油對灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的最低抑菌浓度MIC及最小杀菌浓度MFC分别为0.03 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1。

关键词：蓝莓;灰霉病;肉桂精油;体外熏蒸

中图分类号：S663            文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.014

Identification of Gray Mold Rot Pathogen on Blueberry Fruit and Inhibitory Effect of Cinnamon Bark Oil

WANG Dan1， XIN Li1， ZHANG Jing1， YANG Juanxia1， ZHAI Hao1， DONG Chenghu2

（1.Shandong Institute of Pomology， Tai'an， Shandong 271000，China;2.National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products， Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products， Tianjin 300384， China）

Abstract： The study was aimed to identify gray mold rot pathogen in postharvest blueberry， in Taian， Shandong province and the antifungal effect of cinnamon oil. Based on traditional morphological identification method， rDNA-Internal transcribed spacer （ITS） analysis and phylogenetic tree， the strain was identified as Botrytis cinerea. Cinnamon bark oil exhibited obvious antifungal effect on Botrytis cinerea， and the MIC and MFC were 0.03 μL·mL-1 and 0.06 μL·mL-1， respectively.

Key words： blueberry; gray mold rot; cinnamon oil; in vitro fumigation

蓝莓（Vaccinium）属杜鹃花科、越橘属植物，其果实富含多酚类、有机酸类、糖类、矿物质类等营养成分[1-2]，具有营养保健作用，受到越来越多消费者的青睐。但蓝莓果实含水量高，果皮较薄，采收多在高温高湿季节，采前及贮运过程中潜伏的微生物容易在采后适宜的条件下集中发病，最终导致果实腐烂变质，丧失其商品性[3-4]。

灰霉病是蓝莓果实上的主要病害，对产量影响较大，且全国各个蓝莓产区均有发生[5]。戴启东等[6]对蓝莓灰霉病的病原菌进行了鉴定，确定为灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），但此研究主要取自栽培期间病果和病叶，而且仅采用传统真菌形态学的鉴定方法。随着分子生物学的技术的发展，rDNA-ITS 序列分析被广泛应用于植物病原真菌鉴定、分类和系统发育研究[7-8]。

植物精油是一种植物源天然杀菌剂，在保鲜领域的应用越来越受到关注。肉桂精油主要功能成份肉桂醛含量在75%以上，杀菌、抗氧化功能显著[9]。有研究表明，肉桂精油对葡萄、番茄、芒果采后贮藏有明显的保鲜效果[9-11]，但其在蓝莓采后灰霉病控制方面的研究鲜有报道。

本试验对山东泰安产区蓝莓采后货架期灰霉病发病果实分离到的微生物进行分离纯化，采用传统真菌形态学结合菌株ITS序列分析，对所分离到的菌株进行鉴定，分析确定病原菌种属。选用肉桂精油进行体外抑菌试验，为蓝莓采后货架期灰霉病的生物防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

果实：‘晚丰蓝莓，2018年6月21日采自山东省泰安市良庄镇蓝莓合作社，当日运至实验室，挑选颜色大小均匀、无病虫害、无机械伤的健康果实于（25±1） ℃ 条件下放置，待自然发病后进行病原菌的分离鉴定。

试剂：肉桂精油，购自广州恒信香料有限公司，浓度为85%。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ PDA）购自上海盛思生物科技有限公司。

仪器：ChamlGel 6000全自动凝胶成像分析系统 SAGE CREATION;GR110DR 全自动高压灭菌锅 ZEALWAY;SPX-320生化培养箱 宁波江南仪器厂;S1000 PCR仪 BioRad;PowerPac Basic 电泳仪 BioRad;3730XL全自动DNA测序仪 Applied Biosystems。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 采用常规组织分离法，从自然发病的蓝莓果实病健处切取约2 mm组织，用75%医用酒精表面消毒30 s，无菌水冲洗孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，25 ℃恒温培养。经3～5次划线分离，直至获得纯培养物[12]。

1.2.2 菌株形态学鉴定 将纯化后的菌株接种于PDA培养基，培养一段时间，观察菌落培养性状，包括菌落形状、颜色，菌丝长度、致密性等;挑取菌丝制片，显微镜观察分生孢子的大小、形状、颜色等特征。

1.2.3 致病性检测 根据柯赫氏法则进行致病性检测。取菌落边缘直径为5 mm的菌饼，采用针刺法将菌饼接种于已消毒果实被刺伤部位。以接种无菌的PDA培养基块作为对照，在25 ℃温度条件下培养7 d后观察发病情况。每种病原菌处理3个重复，每个重复15个果实。发病后于病斑处再次分离培养病原菌，与原接种菌株对比，形态学鉴定一致则确定为该病原菌。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定 利用CTAB提取菌株DNA，选用真菌通用引物 ITS1和ITS4对病原菌进行PCR 扩增。

引物序列：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）

扩增程序：94 ℃ 变性 5 min;94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，测序结果在NCBI 数据库中进行 BLAST 比对分析，搜索同源性较高的已知序列，用 DNAMAN 软件对已知序列计算相似性;利用MEGA 5.2 软件以 NJ（Neighbor-Joining）法构建系统发育树。

1.2.5 肉桂精油对病原菌的体外抑菌试验 选择61 mL（直径75 mm）的培养皿，取一片直径为30 mm的滤纸贴在皿盖中央，与培养皿一同灭菌后使用。倒入PDA培养基后，用无菌打孔器取直径7 mm的病原菌菌饼接入，分别取一定量的肉桂精油滴于滤纸片中央，使其体积含量分别为0.030，0.060，0.090 μL·mL-1，不加精油的为对照组。于25 ℃温度条件下培养4～5 d，采用十字交叉法测量菌落直径并计算抑菌率。以48 h内抑制率100%的最低精油浓度为其最低抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration， MIC），继续培养48 h，若仍不长菌，则为最小杀菌浓度（Minimal Fungicidal Concentration， MFC）。每个浓度梯度重复4次。

抑菌率（%）=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]× 100

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0对数据统计分析，采用Duncan's 多重比较进行显著性分析，P<0. 05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及鉴定

在PDA培养基上（图1a），菌丝初为白色绒状，然后颜色变为浅褐色，形成黑色菌核。分生孢子（图1b）数根丛生，直立或稍弯曲，具隔膜，顶端呈1～2次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。分生孢子卵圆形、椭圆形，无色至淡褐色，单孢，（8.3～11.3） μm×（6.3～10.1） μm。

将分离纯化的菌株采用穿刺法接种于蓝莓健康果实，3～5 d症状显现，7 d后发病严重，与原发病状较一致，重新分离后，其培养性状与原菌株相同，而对照处理不发病（图1c）。根据柯赫氏法则，确定该病原菌为灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。

将菌株ITS全序列在GenBank数据库中进行同源比对，与其相似序列用MEGA 5.2软件的最大似然法（Maximum Likelihood， ML）构建系统发育树，以明确病原菌分类地位。

从图2中看出，菌株G与意大利（寄主不详）灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）（KT587323.1）、美国（寄主不详）富氏葡萄孢盘菌（Botryotinia fuckeliana）（AY544695.1）、爱沙尼亚的寄生桦木的蜡盘菌（Rutstroemia firma）（KX138402.1）聚在同一枝。结合孢子形态特征，将分离自蓝莓灰霉发病部位菌株鉴定为灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。

2.2 肉桂精油对Botrytis cinerea的体外抑菌效果

以体外熏蒸的抑菌试验观察不同浓度肉桂精油对灰葡萄孢霉菌丝生长延伸量的抑制作用，如图3所示，0.03 ～0.09 μL·mL-1浓度范围内，随浓度增大，抑菌活性增强。0.06 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1这2个浓度在培养72 h内，均未见菌丝生长和蔓延，抑菌率为100%。在浓度0.09 μL·mL-1时，144 h内抑菌率均达100%，0.06 μL·mL-1浓度下，144 h 内抑菌率基本在80%以上，而在0.03 μL·mL-1浓度下，72 h内抑菌活性相对较强，培养120 h后，抑菌率即降至52.12%，120 h后，基本没有抑制效果。肉桂皮精油对灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的最低抑菌浓度MIC及最小杀菌浓度MFC分别为0.03 μL·mL-1和0.06 μL·mL-1。

3 结论与讨论

经形态学鉴定、rDNA-ITS序列分析及回接试验证实，山东泰安产区‘晚丰蓝莓采后果实灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起。肉桂精油对灰葡萄孢霉體外熏蒸抑菌效果显著，最低抑菌浓度MIC及最小杀菌浓度MFC分别为0.03 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1。陈倩茹等[13]通过触杀方式测定了香茅精油对灰葡萄孢完全抑制效果的浓度为1.5 μL·mL-1，与本试验肉桂皮精油的有效浓度相差10倍以上，笔者分析这与精油的类型有一定关系，但最主要原因还是作用方式的不同，触杀用量要远高于熏蒸处理。这与施俊凤等[14]研究较为一致，其结果为百里香精油通过熏蒸和直接接触作用对番茄灰霉病的抑制浓度分别为0.1 μL·mL-1和1.6 μL·mL-1，但精油具体的抑菌机制有待进一步阐明。

参考文献：

[1]Castrej  n  A D R， Eichholz I， Rohn S， et al. Phenolic profile and antioxidant activity of highbush blueberry（Vaccinium corymbosum L.） during fruit maturation and ripening[J]. Food chemistry，2008，109（3）：564-572.

[2]ZAFRA-STONE S， YASMIN T， BAGCHI M， et al. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention[J]. Mol nutr food res， 2007， 51： 675-683.

[3]PERKINS-VEAZIE P， COLLIN J K， HOWARD L. Blueberry fruit response to postharvest application of ultraviolet radiation[J]. Postharvest biology and technology， 2008， 47（3）：280-285.

[4]郑永华.高氧处理对蓝莓和草莓果实采后呼吸速率和乙烯释放速率的影响[J].园艺学报， 2005， 32（5）：866-868.

[5]周福慧， 姜爱丽， 姬亚茹， 等. 纳他霉素对采后蓝莓果实灰霉病防治[J].食品工业科技， 2018， 39（8）：257-260， 317.

[6]戴启东， 李广旭. 蓝莓灰霉病病原鉴定和生物学特性研究[J]. 中国果树， 2011（3）：46-48.

[7]ODONNELL K， CIGELNIK E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous[J]. Molecular phylogenetics and evolution， 1997， 7：103-116.

[8]MARMEISSE R， DEBAUD J C， CASSELTON L A. DNA probes for species and strain identification in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma[J]. Mycological research， 1992， 96：161-165.

[9]吕明珠， 于爽， 朱恩俊. 肉桂精油对红提葡萄保鲜效果的影响[J].食品科学， 2016， 37（6）： 272-277.

[10]张娜娜， 张辉， 马丽， 等. 肉桂醛对番茄采后灰霉病的抑制作用及其对品质的影响[J].食品科学， 2014， 35（14）： 251-255.

[11]柳风， 詹儒林， 何衍彪， 等. 抑菌物质肉桂醛防治杧果炭疽病机制研究[J].果树学报， 2011， 28（4）： 651-656.

[12]解淑慧， 邵兴锋， 王可， 等. 柑橘采后腐烂主要致病菌的分离鉴定及丁香精油对其抑制作用研究[J]. 果树学报， 2013， 30（1）： 134-139，181.

[13]陳倩茹， 徐仕翔， 余挺， 等. 香茅精油体外和体内对樱桃番茄致病菌灰葡萄孢的抑制性研究[J]. 中国食品学报， 2014， 14（10）： 49-54.

[14]施俊凤， 孙常青， 王潇冉， 等. 番茄采后病原鉴定及百里香精油生物活性研究[J]. 中国食品学报， 2016， 16（2）： 224-232.