陈磊，刘羽彤，童群义

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

我国作为一个农业大国，拥有大量的棉粕和豆粕资源，且棉籽与豆粕具有售价低、氨基酸组成合理等特点，是我国饲料原料的首选[1-2]。但由于棉籽和大豆中含有的抗营养因子——低聚糖，尤其是棉籽糖的含量较高，严重的影响了应用及营养因子的吸收利用。棉籽糖(raffinose)是一种由一分子的半乳糖、葡萄糖、果糖组成的功能性低聚糖，非还原糖，又称为蜜三糖、棉实糖、棉子糖，分子式为C18H32O16，相对分子质量为504.46。棉籽糖在热和酸的环境中有较强的稳定性[3]，很难通过常规理化方法去除。

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)又称密二糖酶，能水解通过α-1, 6-键结合的末端半乳糖残基类物质(蜜二糖、棉籽糖、糖鞘脂、糖蛋白等)[4]。由于人和单胃动物体内不含有α-半乳糖苷酶，所以无法消化棉籽糖，棉籽糖在进入大肠后被发酵产酸产气，从而引起胀气、呕吐、腹泻等不良现象。利用α-半乳糖苷酶可将结构复杂的低聚半乳糖分解为小分子糖而成被利用，从而有效避免胀气等[5-6]。

此外α-半乳糖苷酶水解半乳甘露聚糖的侧链促进β-甘露聚糖酶水解[7]，或通过转糖苷合成α-低聚半乳糖及其他重要的新型糖苷化合物[8]。微生物中α-半乳糖苷酶常见于细菌和真菌中，仅有少数来自于古菌。近年用于基因克隆和酶活高效表达的菌种有BacteroidesfragilisNCTC9343[9]、Dictyoglomusthernaophilum[10]、Mesorhizobiumsp. JB07[11]、Porrtibactersp.HJ8[12]、NeosartoryafischeriP1[13]、TalaromycesleycettanusJCM12802[14]。本实验旨在筛选出可以高效利用棉籽糖的菌种，并对其酶学性质进行研究，为含有棉籽糖原料中棉籽糖的消除应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

由饲料工厂附近土壤中筛选和实验室保存的菌种。

1.2 材料与试剂

对硝基苯α-D-半乳糖苷、对硝基酚、棉籽糖：麦克林公司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3 仪器与设备

SJ-CJ-1FD超净工作台，苏净公司；GI80T灭菌锅，致微(厦门)仪器有限公司；UV-2800a型分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；One Shot 1532型超高压破碎机，Constant Systems LTD；FE28型pH计，梅特勒-托利多公司；ZQZY-70BF型双层振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；GH-400BC型恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；RJ-TGL-1850R高速冷冻离心机，无锡瑞江分析仪器有限公司。

1.4 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖20，酵母膏10。

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，葡萄糖20，三水醋酸钠5，吐温80 1，柠檬酸三铵2.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05。

发酵培养基：将上述生长培养基中的葡萄糖用等量的棉籽糖取代。

1.5 方法

1.5.1 生物量的测定

取发酵液选择2～3个连续的适宜稀释浓度，每个稀释度分别吸取200 μL均匀涂布于培养基平板上，37 ℃恒温培养48 h后计数，每个浓度做 3次平行。

1.5.2 棉籽糖降解能力研究

棉籽糖含量采用GB 5009.258—2016测定。

1.5.3 α-半乳糖苷酶活力测定方法

α-半乳糖苷酶酶活测定参考GARROAO等[15]的方法并做适当修改。取适量发酵液，10 000×g离心15 min， 收集细胞沉淀。用柠檬酸钠缓冲液洗涤细胞体，悬浮于1 mL缓冲液中，置于高压细胞破碎机破壁，12 000×g离心20 min，上清液即为粗酶液。

将10 mmol/L pNPG溶液200 μL，柠檬酸缓冲液100 μL和粗酶液100 μL混合，37 ℃反应15 min，加入3 mL Na2CO3缓冲液，于405 nm处测定吸光度[15]。

1.5.4 酶学性质研究

1.5.4.1 α-半乳糖苷酶的最适pH和pH稳定性

将粗酶液在不同的pH下，以pNPG法37 ℃测定不同pH值下的酶活。以测得的最高值为100%，其余数据折算。

将粗酶液在37 ℃，不同pH缓冲液中反应2 h，以各pH值下反应15 min时测得的酶活为基准酶活(100%)，其余的数据折算，绘制pH稳定性曲线。

1.5.4.2 α-半乳糖苷酶的最适温度和热稳定性

将粗酶液在不同的温度下，以pNPG法最适pH值下测定不同温度时的酶活。以测得的最高值为100%，其余数据折算。

将粗酶液在最适pH值时，不同温度中反应2 h，每30 min取样以pNPG法测定酶活，以各温度值时反应15 min时测得的酶活为基准酶活(100%)，其余的数据折算，绘制热稳定性曲线。

1.5.4.3 不同金属离子对酶活的影响

用浓度为 10 mmol/L的Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、K+、Na+、Mg2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Ag+、Hg2+溶液分别与粗酶液以1:1的比例进行混合，37 ℃保存1 h后，在最适条件下测定酶活。以未处理的酶液的酶活为100%计[16]。

1.5.4.4 粗酶液对蛋白酶的抗性研究

将粗酶液与1 g/L的胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A、碱性蛋白酶溶液按 10:1比例反应30 min， 按pNPG法测定酶的剩余酶活。以未处理的酶液的酶活为100%计[17]。

2 结果与分析

2.1 生物量的测定

各菌种分别用无碳源培养基和棉籽糖为唯一碳源培养基分别培养48 h，梯度稀释后选取3个适宜的稀释度涂布平板，培养48 h后进行计数，结果如表1所示。

由表可知所有菌种都可利用棉籽糖进行生长，凝结芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌在棉籽糖培养基中比无碳源培养基中分别高出了45.33、38.24、31.58倍，说明3种菌可更好地利用棉籽糖进行生长。

2.2 棉籽糖降解能力

以GB 5009.258—2016所述方法测定发酵结束后棉籽糖的剩余含量，结果如表2所示。

表2 不同菌种对棉籽糖的降解能力 单位：%(质量分数)

由表可以看出，发酵48 h小时后各菌种均表现出对棉籽糖良好的降解能力，乳酸菌表现出优于芽孢杆菌和酵母的分解能力。乳酸菌可分解85%以上的棉籽糖，屎肠球菌和粪肠球菌可以完全或基本完全分解棉籽糖。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分解能力低于乳酸菌，但凝结芽孢杆菌也表现出优异的分解棉籽糖的能力，发酵48 h可分解98.95%的棉籽糖。

2.3 酶学性质研究

由上述实验可看出屎肠球菌、粪肠球菌、凝结芽孢杆菌可利用棉籽糖进行良好的生长，并且3种菌都表现出优异的分解棉籽糖的能力，基于以上结果，本部分实验将进一步对3种菌的粗酶液的酶学性质进行研究。

2.3.1 α-半乳糖苷酶的最适温度和热稳定性

以pNPG法测定3种菌不同温度时的酶活，结果如图1所示。由图1可知,凝结芽孢杆菌和屎肠球菌的最适温度均为45 ℃，粪肠球菌的最适温度为50 ℃。 随着温度升高酶活逐渐增加，当达到最适温度后酶活随着温度的升高而快速下降。

图1 不同菌种的α-半乳糖苷酶的最适温度Fig.1 Optimum temperature of α-galactosidase from different strains

在实际生产中对酶的热稳定性有着不同的要求，例如在饲料加工工艺中关键控制点调质温度一般为55～65 ℃，制粒和膨化温度可达到70 ℃以上[16]，且完整加工过程中物料会在高温环境下保持较长的时间，所以酶的热稳定性对于酶的应用至关重要。将3种粗酶液分别置于37、50、55、60、65 ℃下保持120 min，每30 min以pNPG法测定剩余酶活，结果如图2所示。由图可知：随着加热时间的延长酶活逐渐降低。粪肠球菌在37 ℃时酶活可保持较高水平，超过50 ℃后酶活严重下降，65 ℃, 120 min后基本失活。屎肠球菌在37和50 ℃酶活可保持在80%以上，55与60 ℃ 在120 min后酶活维持在45%以上，65 ℃时酶活仅剩20%。凝结芽孢杆菌在37和50 ℃时酶活可保持在90%以上，55 ℃时也可保持在近65%，在65 ℃ 时30 min仍可保持55%左右，但时间继续增加后酶活严重下降，酶活在120 min时为18%。3种α-半乳糖苷酶都表现出优于普通菌种[18-19]的热稳定性，但差于嗜热菌NeosartoryafischeriP1[20]、Geobacillusstearotherrnophilus[21]、新阿波罗栖热袍菌[22]所产α-半乳糖苷酶的热稳定性。

a-粪肠球菌；b-屎肠球菌；c-凝结芽孢杆菌图2 α-半乳糖苷酶的热稳定性Fig.2 Thermal stability of α-galactosidase

2.3.2 α-半乳糖苷酶的最适pH和pH稳定性

在37 ℃条件下，以pNPG法测定3种α-半乳糖苷酶在不同pH缓冲液时的酶活，结果如图3所示。

图3 不同菌种的α-半乳糖苷酶的最适pHFig.3 Optimum pH of α-galactosidase from different strains

由图3可以看出,粪肠球菌和屎肠球菌α-半乳糖苷酶在pH值为4～8具有较高的酶活，均可保持60%以上，最适pH值为5。凝结芽孢杆菌α-半乳糖苷酶最适pH值为8，其在6～11具有>60%的较高的酶活。

将粗酶液在37 ℃各pH值条件下反应120 min，以pNPG法测定3种酶在不同pH缓冲液时的剩余酶活，以各pH值时反应15 min时测得的酶活为基准酶活(100%)，结果如图4所示。

图4 不同菌种的α-半乳糖苷酶的pH稳定性Fig.4 pH stability of α-galactosidase from different strains

由图4可知, 3种α-半乳糖苷酶在最适pH处都具有最高的稳定性。这与董岩岩[16]、DU[23]、HU[24]已报道的α-半乳糖苷酶的pH稳定性的结论相同，但与叶雪飞等[25]的结论相反。屎肠球菌和粪肠球菌α-半乳糖苷酶在pH 3～9都可保持在80%以上，但在最适pH处屎肠球菌α-半乳糖苷酶酶活高于粪肠球菌α-半乳糖苷酶。凝结芽孢杆菌α-半乳糖苷酶在pH 6～9具有90%以上的酶活，尤其是在最适pH处具有98%的相对酶活。

2.3.3 金属离子对α-半乳糖苷酶酶活的影响

由表3可以看出，不同金属离子对α-半乳糖苷酶有着不同的影响，且同一种金属离子对不同的α-半乳糖苷酶的影响程度也不尽同。

表3 金属离子对α-半乳糖苷酶酶活的影响Table 3 Effect of metal ions on α-galactosidase activity

注：数据由3个独立试验的均值± SD所示。

大部分金属离子会对3种不同的α-半乳糖苷酶产生轻微的抑制作用，Zn2+离子对3种α-半乳糖苷酶有轻微的促进作用，Mn2+对α-半乳糖苷酶酶活具有明显的促进作用。Ag+、Hg2+可完全抑制3种不同的α-半乳糖苷酶的酶活，这也与之前的报导结果[24,26-27]相一致。

2.3.4 α-半乳糖苷酶对蛋白酶的抗性研究

将粗酶液与胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A、糜蛋白酶溶液按 10∶1比例反应30 min，按pNPG法测定酶的剩余酶活。由图5可看出，粪肠球菌α-半乳糖苷酶对蛋白酶K有较好的抗性，但对其余蛋白酶的抗性较差。屎肠球菌α-半乳糖苷酶对糜蛋白酶的抗性较差为72%，其余3种酶抗性较好均>80%。凝结芽孢杆菌α-半乳糖苷酶对4种蛋白酶均表现出优异的抗性，剩余酶活均>89%。

图5 蛋白酶对α-半乳糖苷酶酶活的影响Fig.5 Effect of protease on α-galactosidase activity

3 结论

从饲料工厂土壤中和实验室已保存菌种中筛选出了3种可高效利用棉籽糖的菌种，分别是屎肠球菌、粪肠球菌和凝结芽孢杆菌。

对粗酶液的酶学性质研究表明：屎肠球菌α-半乳糖苷酶最适温度为45 ℃，在55 ℃内有较高的热稳定性，对4种蛋白酶有较好的抗性。粪肠球菌α-半乳糖苷酶最适温度为50 ℃，对蛋白酶K有较好的抗性。屎肠球菌α-半乳糖苷酶与粪肠球菌α-半乳糖苷酶最适pH值均为5，在pH 3～9可保持较高酶活。凝结芽孢杆菌α-半乳糖苷酶最适温度为45 ℃，最适pH为8，在55 ℃内和pH 6～12可保持较高酶活，对4种蛋白酶有优异的抗性。Mn2+对3种α-半乳糖苷酶酶活具有明显的促进作用，Ag+、Hg2+可完全抑制其酶活。

本实验筛选到的3种菌种可为饲料、豆奶等中棉籽糖的消除提供理论基础。下阶段将对粗酶液进行高效表达并分离纯化得到高活性的α-半乳糖苷酶，并探究其实际应用效果。