蜂产品中新烟碱类农药检测前处理方法研究进展

2019-06-06伍思源陈文彬涂熹娟缪晓青

中国蜂业 2019年5期

伍思源陈文彬涂熹娟缪晓青,

（1 福建农林大学食品科学学院，福州 350002；2 福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

蜂产品质量安全决定了养蜂业的经济效益，农兽药残留是引起蜂产品质量下降的重要因素之一，然而蜂产品样品基质复杂，需要经过提取、净化、浓集等一系列步骤才能用于仪器检测。因此，需要开发简单、快速、有效、稳定的前处理方法用于蜂产品中农兽药残留的检测。

新烟碱类农药是一种相对较新的类尼古丁农药，作用于昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体，是世界上应用最广泛的农药之一。过量使用新烟碱类农药可能直接污染蜂产品，也可能通过污染环境如土壤、水源、蜜粉源植物等间接污染蜂产品。目前，检测蜂产品中新烟碱类农药的前处理方法主要有固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）、QuEChERS等。

1 蜂蜜

蜂蜜有丰富的营养成分，含有大量的糖类物质，此外还包括微量元素和生物活性物质，如酚类化合物、矿物质、蛋白质、有机酸、游离氨基酸、酶和维生素等[1]，这也使得蜂蜜基质比较复杂。蜂蜜中新烟碱类农药检测的前处理方法总结于表1中。

Fidente P[2]等人将SPE应用于蜂蜜中新烟碱类农药的检测。该研究将蜂蜜溶于纯水中，然后转移到含硅藻土的SPE柱中，用二氯甲烷洗脱SPE柱。通过LC-ESI-MS分析了4种新烟碱类农药。

Song SM[3]等人使用一次性移液器提取法（DPX）测定了蜂蜜中的8种新烟碱类农药。该文献研究了2种离子交换剂（QAE Sephadex A-25和SP Sephadex C-25），发现QAE Sephadex A-25阴离子交换剂效果更好。此外，还对比了阴离子交换剂-DPX法和QuEChERS法，结果显示离子交换剂-DPX法不但回收率更高，而且可以净化糖、水溶性色素、无机盐等物质，从而降低基质效应甚至可以不考虑基质效应。

Jovanov P[4]等人将分散液液微萃取（DLLME）用于蜂蜜样品前处理方法，使用液相色谱-串联质谱法测定了蜂蜜样品中的7种新烟碱类农药。该研究将乙腈作为分散剂，二氯甲烷作为提取剂处理蜂蜜样品。然后经过涡旋、超声、离心、干燥、复溶等步骤，通过LC-MS/MS进行检测。

Malgorzata Gbylik-Sikorska[5]等人测定了蜂蜜样品中多达13种目标物。该研究将蜂蜜加入到含有水、乙腈、乙酸乙酯、三乙胺的混合溶液中，涡旋、超声、离心后将上清液转移到SPE柱中。用乙腈和乙酸乙酯混合物作为洗脱液洗脱两次，该研究发现在提取剂中加入三乙胺-乙腈溶液可以提高回收率。

Gina Tanner[6]等人比较了两种前处理方法（SPE和QuEChERS）测定蜂蜜中的8种新烟碱类农药及2种代谢物。SPE方法是将蜂蜜溶于水中，再加入甲醇，用滤纸过滤，硅藻土作为助滤剂。然后把滤液中的有机溶剂蒸发干燥，将水溶液转移到ChemElut 1020柱上，用环己烷和乙酸乙酯混合溶液洗脱。QuEChERS方法是将蜂蜜溶于水和乙腈中，加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，进行提取，将上清液转移到含有无水硫酸镁和PSA的离心管中净化。结果显示，SPE方法对于烯啶虫胺和呋虫胺的回收率较低；而采用QuEChERS方法处理蜂蜜样品，回收率得到了显著提高。此外，Bridi R[7]等人也用QuEChERS方法，通过LC-MS/MS分析了智利地区蜂蜜中的4种新烟碱类农药。

Campillo N[8]等人提出了固相萃取与分散液液微萃取（SPE-DLLME）相结合的方法测定蜂蜜中5种新烟碱类农药。该研究将蜂蜜溶于水中，转移至SPE小柱，用乙腈洗脱。随后进行DLLME步骤：将SPE的洗脱液转移到氯化钠水溶液中，加入CHCl3作为提取剂，离心后收集下层溶液，干燥复溶，注入LC系统。该研究还比较LC-DAD和LC-MS/MS的结果。

在国内，李菊颖[9]等人用QuEChERS方法处理蜂蜜样品，用乙腈和水作为提取剂，PSA和无水硫酸镁作为净化剂处理蜂蜜样品，然后通过UPLC-MS/MS同时测定了蜂蜜中的6种新烟碱类农药。粟有志[10]等人用水作为提取剂加入到蜂蜜中，用PSA和酸性Al2O3净化样品，通过LC-MS测定了蜂蜜中的9种新烟碱类农药。王东[11]等人采用盐析辅助均相液液萃取结合分散固相萃取法处理蜂蜜样品，该研究在蜂蜜中加入水和乙腈，并且加入氯化钠进行提取，取上清液加入无水硫酸镁和PSA净化。吕冰[12]等人也是在乙腈水体系中加入氯化钠进行提取，但是用PPVP进行净化。因为PPVP不仅能除去蜂蜜中的酚酸类物质，而且价格比较便宜。

表1 蜂蜜中新烟碱类农药检测的前处理方法总结

2 蜂花粉

蜂花粉是蜜蜂采集时带回的花粉团，营养成分包括碳水化合物、蛋白质、脂类、维生素、矿物质、多酚和少量其他成分[13]。由于其复杂的基质组成，加大了样品提取、净化的难度。蜂花粉中新烟碱类农药检测的前处理方法总结于表2中。

Olalla Ló pez-Fernández[14]等人在研磨过的蜂花粉中加入纯水、乙腈、无水硫酸镁、乙酸钠进行提取。摇动、离心后取上清液，再次加入硫酸镁去除水分，再离心取上清液过SupelcleanTMENVI-Carb II/PSA柱，用乙腈洗脱，将洗脱液用氮气吹干，加水复溶，然后通过HPLC-MS/MS分析了7种新烟碱类农药。

Mei Chen[15]等人测定了蜂花粉中的8种新烟碱类农药。该研究将蜂花粉研磨成细粉，加入水、乙腈和正己烷摇匀后，加入一个QuEChERS试剂盒和一个陶瓷均质机充分提取，用含有PSA、C18和MgSO4的d-SPE小瓶净化。Valverde S[16]等人也采用QuEChERS方法处理蜂花粉样品，同时测定了样品中的7种新烟碱类农药。不同之处在于提取上清液后会放置在有干冰的聚苯乙烯盒中2min，以沉淀脂肪和蛋白质。

Karen P.Yá ñez[17]等人使用了一种十分简单的前处理方法处理蜂花粉样品，测定了样品中的7种新烟碱类农药。该方法将二氯甲烷加入花粉中，振动混合，离心，提取上清液，用滤纸过滤，蒸发干燥，用乙腈水复溶。该方法与其他方法相比较为简单、快速。

3 蜂王浆

蜂王浆是一种功能性食品，在营养学和化妆品中具有潜在价值，其主要成分是蛋白质、碳水化合物以及脂质[18]。蜂王浆中新烟碱类农药检测的前处理方法总结于表3中。

侯建波[19]等人采用QuEChERS方法处理蜂王浆样品，通过LC-MS/MS测定样品中的10种新烟碱类农药及2种代谢产物。该研究用水和甲醇提取蜂王浆中的农药，PSA、C18和无水MgSO4作为分散剂净化样品。干燥样品后，用甲酸水-甲醇溶液复溶。

Silvia Valverde[20]等人测定了两种不同蜂王浆产品（液体膳食补充剂和新鲜蜂王浆）中的7种新烟碱类农药。根据该研究报道，液体膳食补充剂使用SPE处理，将液体膳食补充剂用甲酸铵水溶液稀释，采用SPE试剂盒，用甲醇和乙酸乙酯混合液洗脱。而新鲜蜂王浆则使用DLLME方法处理，将新鲜王浆用乙腈和氯仿进行提取，而且加入两次氯仿，重复提取。对于液体膳食补充剂，他们还同QuEChERS方法进行对比，但是QuEChERS方法会形成一个界面，难以收集上清液，因此使用SPE方法。对于新鲜王浆，他们也同SPE方法和QuEChERS方法进行了对比，但是结果发现SPE方法会堵塞SPE柱，QuEChERS方法也会形成一个界面，所以最后选择了DLLME方法进行前处理。

表2 蜂花粉中新烟碱类农药检测的前处理方法总结

表3 蜂王浆中新烟碱类农药检测的前处理方法总结

表4 蜂蜡中新烟碱类农药检测的前处理方法总结

4 蜂蜡

蜂蜡主要由脂肪酸、脂肪醇、链烷烃和游离脂肪酸的混合物组成。养蜂活动中使用的新烟碱类农药具有低挥发性和持久性[21]，而且，养蜂实践中，通常会熔化旧的蜂蜡作为制造新蜂蜡的原料，所以新烟碱类农药在蜂蜡上可能逐渐积累。蜂蜡被污染，意味着相关的蜂产品也有被污染的风险[22]。蜂蜡中新烟碱类农药检测的前处理方法总结于表4中。

Karen P.Yá nez团队于2013年发表了一篇测定蜂蜡样品中吡虫啉的研究[23]和一篇测定蜂蜡样品中7种新烟碱类农药的研究[24]。他们使用LLE-SPE结合的方法处理蜂蜡样品，在蜂蜡样品中加入正己烷和异丙酮的混合溶液，然后加热使蜂蜡熔化，再加水进行提取。将提取液转移到SPE柱中，并加入丙酮洗脱。

Claire Jabot[25]等人将蜂蜡融于戊烷中，然后倒入含有硅藻土的离心管中，干燥离心管，加入酸化的乙腈溶液进行洗脱，将洗脱液放在-18℃下静置15h，以沉淀杂质。氮吹干燥后，用甲醇水复溶，通过LC-MS检测样品中的新烟碱类农药。该研究还尝试了单一溶液和混合溶液的液液萃取，但效果不好，因此选择了固相萃取技术。此外，他们还发现在氮吹干燥前加入二甲基亚砜可以提高回收率。

Silvia Valverde[26]等人将甲醇和乙酸乙酯的混合物作为提取剂，用干冰冷冻沉淀杂质，然后将上清液转移到EMR-Lipid SPE管中净化。该研究结果还显示商业化的EMR-Lipid管能有效净化蜂蜡基质。