武鸿彪 袁旦平 曹跃鹏 庞洪双 刘东方 傅超 陶勇

结直肠癌是目前临床最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内发病率居恶性肿瘤第3位，且死亡率逐年上升[1]。近年来，尽管结直肠癌的手术方式、放化疗及靶向药物治疗等研究均取得了较大进展，但患者预后依然欠佳。因此，进一步分析影响结直肠癌患者预后的相关因素，寻找有助于临床诊治的指标、标志物或新靶点是目前临床研究的热点与难点[2]。结直肠癌的发生、侵袭、转移涉及基因突变、内环境改变、细胞信号通路异常、免疫系统失调等多个复杂的病理生理过程，相应血清标志物亦能监测其变化[3]。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）属于基质金属蛋白酶（MMP）家族成员，在肿瘤发生、发展过程中可促使肿瘤细胞沿基底膜向周围组织浸润，加速肿瘤形成或扩散[4]。同时基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）为组织金属蛋白酶抑制剂家族的一员，由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞合成，可通过与活化的MMP-9或与MMP-9潜酶结合等方式，阻断其过度活化，是MMP-9的天然抑制剂[5]。钙黏附蛋白E（E-cadherin）参与降低肿瘤细胞间的粘连，促进肿瘤转移。基于此，本研究采用ELISA法检测结直肠癌患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin 水平，分析其与患者临床特征及预后的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010年1月至2013年1月本院肛肠外科收治的行手术切除治疗并经病理学检查证实结直肠癌患者102例。其中男71例，女31例；年龄45～80（62.11±14.27）岁；结肠癌70例，直肠癌32例。患者术后按照美国癌症联合委员会（AJCC）结直肠癌TNM分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期29例，Ⅲ期39例，Ⅳ期20例。所有患者均排除心、肝、肾等重要器官疾病，无合并严重内科疾病，无其他部位原发肿瘤及转移瘤。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平检测 采集患者术前空腹静脉血4 ml于专用血清采集管中，室温静置 1 h 后离心（4℃，1 600 g，10 min），吸取上清液于-80℃保存，使用前置于冰上溶解。MMP-9、TIMP-1及E-cadherin ELISA检测试剂盒购自深圳晶美生物工程公司，按说明书指导加入标本稀释液与定量标准品，样品孔每孔加入50μl样品稀释液及50μl标本，然后分别加入50μl人抗MMP-9、TIMP-1及E-cadherin抗体。酶标仪（美国BioTech公司）检测各孔标本吸光度值，绘制标准曲线，并计算各标本MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平。

1.2.2 临床特征收集 记录患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分级、肿瘤TNM分期等临床特征资料。

1.2.3 预后观察 患者术后随访由专门的随访小组通过电话、信函及门诊等方式进行，记录患者肿瘤复发转移和死亡时间，随访截止至2018年1月，观察并记录患者无复发生存情况与总生存情况。无复发生存时间是指手术之日起至第1次出现肿瘤局部或区域复发转移、随访终止的时间；总生存时间是指手术之日起至患者死亡、随访终止的时间。

1.3 观察指标 （1）观察患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平预测预后的最佳截点：通过绘制ROC曲线计算患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平预测预后（随访5年生存或死亡）的最佳截点，并以此将患者分为高（≥截点）与低（＜截点）MMP-9组、TIMP-1组、E-cadherin组。（2）比较高MMP-9组与低MMP-9组、高TIMP-1组与低TIMP-1组、高E-cadherin组与低E-cadherin组患者临床特征、无复发生存情况与总生存情况。（3）分析结直肠癌患者预后的影响因素。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，两组患者生存率的比较采用log-rank检验；单因素与多因素分析采用Cox比例风险模型；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平预测预后的最佳截点 以随访5年患者是否生存为结果，绘制患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平预测预后的ROC曲线，见图1-3。

图1 结直肠癌患者血清MMP-9水平预测预后的ROC曲线

图2 结直肠癌患者血清TIMP-1水平预测预后的ROC曲线

图3 结直肠癌患者血清E-cadherin水平预测预后的ROC曲线

由图 1-3可见，患者血清 MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平预测预后的 AUC分别为 0.677、0.714、0.654，根据AUC及相应约登指数计算出最佳截点分别为 190、145、73ng/ml。

2.2 高与低MMP-9组、TIMP-1组、E-cadherin组患者临床特征比较 见表1。

表1 高与低MMP-9组、TIMP-1组、E-cadherin组患者临床特征比较[例（%）]

由表1可见，高MMP-9组与低MMP-9组、高TIMP-1组与低TIMP-1组、高E-cadherin组与低E-cadherin组患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），肿瘤TNM分期、肿瘤T期比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。高MMP-9组与低MMP-9组、高TIMP-1组与低TIMP-1组患者肿瘤N期比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 高与低MMP-9组、TIMP-1组、E-cadherin组患者无复发生存情况与总生存情况比较 见图4-9。

图4 高MMP-9组与低MMP-9组患者无复发生存曲线比较

图5 高MMP-9组与低MMP-9组患者总生存曲线比较

图6 高TIMP-1组与低TIMP-1组患者无复发生存曲线比较

图7 高TIMP-1组与低TIMP-1组患者总生存曲线比较

图8 高E-cadherin组与低E-cadherin组患者无复发生存曲线比较

图9 高E-cadherin组与低E-cadherin组患者总生存曲线比较

由图4-9可见，患者随访15～60（中位数43）个月，其中失访6例（其中包括非肿瘤相关死亡）。高MMP-9组与低MMP-9组、高TIMP-1组与低TIMP-1组、高E-cadherin组与低E-cadherin组患者5年无复发生存率分别为24.49%与61.61%、22.53%与61.16%、19.09%与25.31%，5年总生存率分别为24.24%与59.73%、17.69%与50.17%、51.87%与25.91%。高MMP-9组患者5年无复发生存率与5年总生存率均低于低MMP-9组患者（均P＜0.05）。高TIMP-1组患者5年无复发生存率与5年总生存率均低于低TIMP-1组患者（均P＜0.05）。高E-cadherin组患者5年总生存率高于低E-cadherin组（P＜0.05），高E-cadherin组与低E-cadherin组患者5年无复发生存率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 结直肠癌患者预后的影响因素分析 以随访5年患者是否无复发生存、是否生存为结果，分析影响结直肠癌患者预后的因素 见表2、3。

由表2、3可见，结直肠癌患者肿瘤TNM分期晚、淋巴结转移阳性及高TIMP-1水平均是影响患者无复发生存和总生存预后的独立危险因素（均P＜0.05）。

3 讨论

恶性肿瘤的浸润、转移是其主要生物学特征，影响患者治疗效果和预后。浸润、转移是一个复杂、多步骤的肿瘤细胞与机体间互相作用的连续过程。有学者提出了肿瘤细胞浸润、转移机制的三步学说，即黏附、降解和移动，不仅从理论上阐明了浸润的可能步骤，而且涉及肿瘤细胞穿过细胞外基质屏障、基底膜、血管壁及穿出血管壁进入机体微环境的过程[6]。MMP系统、黏附分子及其它生物因子对此过程起重要调控作用，已成为目前临床肿瘤转移机制研究的热点之一。研究发现，上皮细胞来源的肿瘤细胞与正常细胞之间存在某种特殊联系机制。Patil等[7]研究非转化上皮细胞和转化癌细胞的共培养系统，发现癌细胞分泌MMP-9，剪切细胞原癌基因蛋白E-cadherin，进而证实癌细胞可诱导肿瘤上皮-间质转化。同时，MMP可通过降解细胞外基质成分，调节血管生成和上皮-间质转化，参与肿瘤细胞转移过程。TIMP-1通过与作为重要调节剂的MMP结合起作用，并且可以抑制MMP的蛋白水解活性[8]。这种平衡遭到打破可能导致早期肿瘤发展、转移。本研究通过检测结直肠癌患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平，旨在分析其与患者临床特征及预后的关系。

表2 结直肠癌患者无复发生存预后的影响因素分析

表3 结直肠癌患者总生存预后的影响因素分析

有文献指出，在乳腺癌、胰腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中，MMP-9呈高表达，其具有降解蛋白聚糖、层粘连蛋白等的作用[9]。本研究从临床表型入手，以更大的样本量通过ELISA法分析血清MMP-9水平，结果显示在结直肠癌患者中呈高表达，与上述研究结果一致。MMP-9参与恶性肿瘤发生、发展的机制主要包括以下几个方面：破坏基质降解平衡，诱导肿瘤细胞穿过细胞外基质等构成的屏障，重整细胞之间的黏附关系并向周围组织浸润、侵袭，与血管内皮生长因子发挥协同作用，促使新生血管生成[10]。一项Meta分析显示，伴淋巴结转移阳性及高TNM分期的结直肠癌患者血清MMP-9存在高表达水平，进一步说明其可通过降解细胞外基质，促进结直肠肿瘤细胞向肠壁深层浸润、发生淋巴结转移及侵袭[11]。本研究结果显示，血清MMP-9水平与肿瘤自身属性比如肿瘤分期、浸润深度及淋巴结转移阳性等有关。生存分析发现，不同血清MMP-9水平患者5年无复发生存率与总生存率均存在差异，提示MMP-9具有较好的临床预测预后价值。也有学者研究发现，与无肝转移的结直肠患者相比，结直肠癌伴肝转移的患者血清MMP-9水平明显升高[12]。

TIMP是一组抑制MMP活性的低分子量蛋白，尤其是TIMP-1，可通过活化的间质胶质酶、活化的间质溶解素和 MMP-9以1∶1非共价键形成复合物，在肿瘤的浸润和转移过程中起抗浸润和抗转移的作用[13]。肿瘤恶变时MMP-9增高，反应性地调节升高TIMP-1，提示肿瘤生长、浸润不单需要降解周围基质，而且还需要依靠MMP-9/TIMP-1系统重建微环境和调节微血管形成[14]。TIMP-1可抑制肿瘤组织的血管生成，有效地抑制肿瘤的生长和转移[15]。TIMP-1与MMP-9系统失衡会直接影响肿瘤的发展、侵袭、预后。本研究结果显示血清TIMP-1水平与TNM分期、淋巴结转移及浸润深度有关，说明TIMP-1参与结直肠癌的发生、发展。多因素分析显示，TIMP-1、肿瘤分期及淋巴结转移阳性是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素。换而言之，结直肠癌患者血清TIMP-1水平升高可能提示患者预后不良。

除此之外，本研究也探讨了E-cadherin在结直肠癌患者中表达水平与预后的关系。研究发现E-cadherin是一个抑癌基因，其功能异常与许多肿瘤的发生、发展有关[16]。Palaghia等[17]通过对结直肠肿瘤的研究发现，随着肿瘤细胞分化程度的降低、肿瘤直径的增大、浸润深度加深、淋巴结转移及肿瘤分期进展，E-cadherin的阳性表达率会随之降低。E-cadherin表达缺失并可转变为神经组织钙黏蛋白N-cadherin，而后者的重新表达被视为结直肠癌中上皮间质转化的明确特征[18]。N-cadherin还与间质成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞相互作用，利于肿瘤细胞浸润和转移[19]。本研究结果显示，血清E-cadherin水平与肿瘤分期及浸润深度密切有关，而多因素分析显示E-cadherin并非是预后的独立危险因素，E-cadherin水平与结直肠癌患者5年总生存率有关。因此，通过检测血清E-cadherin水平，及时对预后较差的结直肠癌患者进行有效的治疗，可延长患者的生存期。

综上所述，血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平对结直肠癌患者预后有良好的预测价值，高血清MMP-9、TIMP-1及低E-cadherin水平患者提示预后不良。