商 业， 白忠臣， 黎显继， 张正平

(1.贵州大学 大数据与信息工程学院，贵州 贵阳 550025;2.贵州大学 贵州省光电子技术及应用重点实验室，贵州 贵阳 550025)

0 引 言

光谱分析是现代医学实验和工业发展中的一个重要研究方向，与传统的色谱分析[1]、质谱分析[2]和电化学分析[3]等相比，其具有操作方便、消耗试剂量小、重复性好、测量精度高和检测速度快等优点，非常适合对低浓度的检测物进行快速检测。光谱分析可分为发射光谱分析和吸收光谱分析两种。吸收光谱法在高精度检测中是一种快捷、简单并且成本较低的检测方法，适用于蛋白质[4]、氨基酸[5]等生物分子和半导体材料[6]的检测。如何提高吸收光谱灵敏度是近年来研究的热点。目前已经研究出的几种提高吸收光谱灵敏度的技术有光声光谱技术[7]、腔增强光谱技术[8]、积分球技术[9]和衰减全反射红外光谱技术[10]，但这些技术都需要相当复杂且昂贵的设备，以及专业的操作人员。因此，发展新型的低成本、高灵敏度的光谱技术是当前科学研究中的热点。

传统的吸收光谱法受吸收光程等因素的限制，难于进一步提高灵敏度和检测限，限制了其在微小量样品检测中的广泛应用。因此，提高吸收光程是吸收光谱技术的核心问题。多阶散射增强吸收光谱法是一种简单、可调节的光学检测方法，适合测量浓度较低的被检测物[11～13]。与传统的吸收光谱技术相比，多阶散射光谱法能够提高光在被测样品中的光程，进而提高检测灵敏度、降低检测噪声，为微量样品检测提供了一种新的检测方法。多阶散射技术通过悬浮在含有需要检测的样品溶液中的微球使入射光经过被检测样品时发生多次散射，来延长光穿过被检测样品的光路长度。但该技术仍有着传统吸收光谱法的优点:简单、快捷且成本低。

本文通过在Cy3荧光染料水溶液中加入水相单分散的二氧化硅(SiO2)纳米微球，使其充当随机散射介质，从而实现光的多次散射，增加检测光程长度，实现光谱吸收的增强。

1 实 验

1.1 材 料

粒径为200，400 nm的SiO2纳米微球单分散液和表面含羧基的Cy3荧光探针试剂分别购自北京北达巨邦生物技术有限公司和南京拜恩特斯生物科技有限公司。分别取2，4，6，8，10，12 μL的不同粒径的SiO2纳米微球单分散液(0.05 mg/mL)装入容量为4 mL的离心管中，再在每个离心管中加入20 μL的Cy3溶液(0.25 mg/mL)，加入去离子水定容至3 mL，配成水溶液。超声分散2 min，使SiO2纳米微球在含有Cy3荧光试剂的水溶液中均匀分散。

1.2 实验装置

实验采用实验室自行搭建的测量系统进行吸收光谱测量，激发光源 (卤素灯光源)经过贴有三面平面镜(镜面朝内)的盛有待检测溶液的石英比色皿中，由镜面反射所收集到的光透过样品，再经过两面聚光透镜由光纤耦合器传给海洋光学的QE65000科研型光谱仪，最后由计算机进行数据采集与处理。测量系统结构如图1所示。吸收光谱测量范围为350～750 nm。以上所有测量均在室温下进行。

所有被测样品的吸收光谱都经过反复测量。为了消除光源和测量系统对被测样品吸收光谱的影响，对所有被测样品的吸收光谱均进行了归一化处理。

图1 吸收光谱测量系统结构示意

2 数据处理

采用差值法[14]来消除由于纳米SiO2微球自身带来的吸收贡献。实验将含有相同浓度纳米SiO2微球的水溶液和Cy3荧光染料水溶液分为一组，对每组取差值，可得到Cy3荧光染料水溶液的吸收光谱信号

aCy3(λ)=aCb(λ)-ab(λ)

(1)

式中aCb(λ)为Cy3荧光染料水溶液与单分散SiO2微球混合水溶液的吸收光谱信号，ab(λ)为单分散SiO2微球水溶液的吸收光谱信号。aCy3(λ)排除了SiO2微球本身材料的干扰，是只取决于Cy3荧光染料原料本身的吸收特性的吸收光谱信号。

通过计算每组被检测溶液的差值谱就可以排除散射介质自身所带来的干扰，得到Cy3水溶液在不同浓度的SiO2微球作用下的吸收光谱。

3 结果与讨论

当光线通过含有均匀的被测样品的比色皿时，其光路是由盛样品的比色皿决定。如果样品分布不均匀，则通过的光经历多次散射后在空间分布中表现出明显的折射率变化。如图2所示，在未加入SiO2微球前，Cy3溶液的检测光路为l;而在向Cy3的溶液中加入SiO2微球后，由于SiO2微球对光进行了多次散射，使得检测光路比原本的光路l更长，这样就形成了多阶散射增加光程的现象，从而提高了检测的灵敏度。

根据朗伯—比尔定律[15]即式(2)来测量Cy3溶液的吸光度，A=-ln(I/I0)=αCl，其中，I0为入射光强，I为透射光强。当光被透明溶剂中溶解的物质所吸收时，吸收系数α、溶液的浓度C和光程l与吸光度A成正比。因此，采用增加光程l来提高吸光度A。

图2 检测光程及SiO2微球散射示意

本文中光程l的增加与入射光在被检测溶液中通过无序介质SiO2微球的次数有关[11]。光程与入射光通过SiO2微球的平均自由路径(lfree)的倒数成正比

l～1/lfree

(2)

平均自由路径lfree由介质SiO2微球的浓度C、粒径d和散射截面σsca决定的

(3)

式中F=πd3C/6，Qsca为单个SiO2微球的散射效率，g为平均散射角。

一般情况下，当微球尺寸远小于入射光波长时，可采用瑞利散射描述散射光强与光波波长之间的关系;当微球尺寸与入射光波长相当时，则利用米氏散射进行描述[16,17]。本文使用的SiO2微球粒径为200，400 nm，与可见—紫外光波长相近。因此根据米氏散射理论来处理SiO2微球与光的相互作用时的散射特性[18]，对不同半径的SiO2微球在水中的散射效率进行分析，可以得到不同半径的SiO2纳米微球在水溶液中的散射效率Qsca，即Qsca=σsca/πa2，其中σsca为散射截面，a为SiO2纳米微球的半径。如图3所示，在可见光的大部分范围下SiO2微球有相对较高的散射效率(Qsca≈3.5)，在同一波长下，随着SiO2微球半径的增加，散射效率Qsca也在逐渐增加。

图3 不同半径的SiO2微球的米氏散射效率

图4是由实验室自行搭建的测量系统所测得的Cy3水溶液与纯水归一化后的吸收光谱，Cy3水溶液在517 nm和547 nm处各有两个吸收峰，且547 nm处的吸收较高，这与文献中关于Cy3在紫外可见光波段的吸收光谱的相一致[19]。在这里，基线是由装有相同体积纯水的比色皿测量所确定，可以看出，水没有对Cy3水溶液的吸收带来影响。

图4 Cy3水溶液与纯水归一化吸收光

由实验室自行搭建的测量系统测得的粒径为200，400 nm不同浓度SiO2微球与相同浓度的Cy3水溶液混合的吸收光谱经过数据处理后的结果如图5所示。

图5 二种粒径下的不同浓度SiO2微球与Cy3混合的吸收光谱

当粒径一定时，随着SiO2微球含量的增加，Cy3溶液的吸收强度都在逐步增强。这是由于SiO2微球起到了散射作用，SiO2微球浓度的增加，散射作用增强，检测的光程l也逐渐增长，导致Cy3水溶液的吸收也增强了。当SiO2微球到达一定的浓度后，Cy3溶液的吸收不再增强，这是由于高浓度的SiO2微球容易产生聚集，会降低光程的增加，使得随机介质的散射能力减弱。

由图6可以看出，在取相同量SiO2微球单分散液的情况下，粒径为400 nm的微球比粒径为200 nm的微球对Cy3溶液的吸收增强效果更好。在粒径为400 nm的SiO2微球单分散液与Cy3混合溶液中，SiO2单分散液为10 μL时，吸收强度取得最大值，约比不含SiO2微球的Cy3水溶液增强了1.82倍。在粒径为200 nm的SiO2微球单分散液与Cy3混合溶液中，SiO2单分散液为8 μL时，吸收强度取得最大值，约比不含SiO2微球的Cy3水溶液增强了1.63倍。

图6 在λ=547 nm处不同浓度、粒径的SiO2单分散液与Cy3混合的吸收强度

根据式(3)、式(4)和参数F=πd3C/6可以得出，随机介质SiO2微球的浓度C、粒径d，决定了参数F的值，C和d越大，则F的值越大，随机介质间的平均自由路径lfree则会变小，形成多阶散射状态，光程l也随之增加。但是F也有增加的上限，一旦超过这个界限，溶液的吸收不再继续增强反而会降低。

4 结 论

研究发现，随着SiO2微球浓度和粒径的增加，其散射作用不断增强，Cy3溶液中检测的光程l也逐渐增长，被检测的Cy3溶液的吸收明显增强了1.82倍。该实验结果具有潜在的实际应用价值，该方法比传统的吸收光谱检测具有更高的灵敏度和更低的检测限度，为低浓度和短光程的样品检测提供了一种新的方法。