许 玥 陈玉佩张佳怡 陈 洁白玉琢 徐 菁陈 莉 陈冬荔 张淑静 邹德辉 刘 通 张 莉△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.华北理工大学中医学院，河北 唐山 063009；3.广东省第二中医院，广东 广州 510095）

多裂肌的急性损伤是脊柱腰椎后路手术中常见并发症，是引发医源性腰部疼痛的重要原因，近年来受到国内外学者的广泛关注与研究［1]。肌卫星细胞是一类位于骨骼肌基底膜下的成肌前体细胞，其激活与增殖是损伤多裂肌再生修复的关键，Carosio S等［2]发现，骨骼肌剔除肌卫星细胞后，其维持再生修复的能力降低。电针血清是近年研究针刺作用及机理的一种新方法，它不仅可排除在体实验多因素影响的局限性，而且具有直观、快速、敏感的优点，已被广泛应用于各种疾病的研究［3]。课题组前期研究发现，电针“委中”血清和电针“肾俞”血清可上调p-Akt等蛋白的表达，通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）通路促进肌卫星细胞的增殖，加快损伤多裂肌的修复［4]。本实验在此基础上，通过观察电针“委中”大鼠血清对肌卫星细胞成肌分化因子MyoD、周期蛋白CDK4、P57和CyclinD表达的影响，从细胞周期角度进一步探究电针干预骨骼肌损伤修复的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级雄性SD大鼠24只，体质量 （300±10）g，4周龄SPF级雄性SD大鼠1只，体质量120 g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2016-0001。分笼饲养，明暗周期 12 h，自由饮食和饮水，环境温度24℃，湿度40%～50%，适应性饲养7 d。

1.2 试药与仪器 1）仪器：韩氏电针仪（北京思盛达医疗器械中心）；正置智能型显微镜及采集系统（BX53，奥林巴斯，中国有限公司）；蛋白质电泳及转膜系统（美国Bio-Rad公司）；F1uorChemFC2凝胶成像系统（美国A1-phaInnoteeh公司）。2）试药：布比卡因（美国Sigma公司），10%水合氯醛 （北京百诺威公司），青链霉素混合液、DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），Ⅰ型胶原酶（上海吉荧公司），0.25%EDTA-胰蛋白酶 （北京索莱宝公司），PI3K抑制剂LY294002（美国 Selleck公司），蛋白 Marker（美国Thermo公司），β-actin抗体、羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG （北京博奥森公司），MyoD抗体、P57抗体、CyclinD抗体（英国abcam公司），CDK4抗体（美国proteintech公司）。

1.3 造模与分组 多裂肌损伤模型制备方法参照文章［5-6]。 无菌条件下以 10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉。注射器抽取0.5%布比卡因溶液，取脊柱L4、L5水平双侧的4个点，针头紧贴棘突旁垂直进入肌肉，触到关节突和乳突所在的骨面后回抽，如无血则注射布比卡因溶液 400 μL（100 μL×4），时间约 3 s，以利于药物的吸收。单次注射完成造模。大鼠按体质量分层，随机分3组，即空白组、模型组、电针委中组，每组8只。本实验动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见（2006）》［5]的相关规定。

1.4 干预方法 空白组不造模，不做任何处理。模型组：造模完成后，与电针“委中”组同时抓取、固定、取材，不进行电针治疗。电针“委中”组：穴位定位参照《实验针灸学》动物穴位定位法及拟人对照法［7]，选取大鼠双侧“委中”穴（膝关节背面正中）进行电针治疗，干预后第4日取材。电针方法：将大鼠置于固定器上，暴露双后肢，使用0.25 mm×13 mm一次性针灸针，直刺进针后连接韩式电针仪（HANS-200A），选用频率为2 Hz/100 Hz的疏密波，电流强度 1～2 mA，每次 20 min，每日1次，持续3 d。

1.5 标本采集 1）血清：3组大鼠腹主动脉取血5 mL，室温下静置2 h，以3 500 r/min离心10 min，取血清至56℃灭活30 min，无菌条件下经微孔滤膜过滤后移至-20℃冰箱保存备用。原代肌卫星细胞的分离与培养：细胞的分离与培养参照文献［8]。2）多裂肌：3 组大鼠无菌条件麻醉后，剔除大鼠背部皮毛、筋膜，充分暴露腰部肌肉，剥离最长肌和骼肋肌，锐性切取L4和L5水平注射中心部位约1 mm×1 mm×1 mm多裂肌组织，迅速置于40 g/L多聚甲醛溶液固定。3）未处理大鼠多裂肌：另取4周龄雄性SD大鼠1只，不做造模及针刺处理，无菌条件下以过量100 g/L水合氯醛麻醉处死，取L4～5节段多裂肌。以含有青链霉素混合液的PBS冲洗3次，分离多裂肌周围的筋膜后，将肌肉放至预温的以DMEM配制的Ⅰ型胶原酶培养皿中 （5 mL，2 g/L），在37℃的培养箱消化1.5 h，期间每15 min晃动1次；加入等量的完全培养基（DMEM，100 mL/L FBS），反复吹打，使肌纤维完全分离；将细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀重悬后接种至预先用1 g/L明胶包被的培养瓶中；于37℃、50 mL/L CO2培养箱中静置培养3 d。3 d后，显微镜观察到大量细胞贴壁，此时吸出培养基以PBS清洗3次，加入5 mL完全培养基继续培养。当细胞生长至80%汇合时传代。吸出培养基以PBS清洗3次，加入1 mL含EDTA的2.5 mL/L的胰蛋白酶消化液；显微镜下观察到细胞变成圆形后，轻拍培养瓶使绝大部分细胞脱落，加入完全培养基终止消化；反复吹打细胞悬液后离心弃上清（1 000 r/min，5 min）。当细胞沉淀重悬，以1∶3的比例接种于培养瓶后放回培养箱培养1 h，以去除容易贴壁的成纤维细胞（前3次传代均差速贴壁1 h，尽可能去除成纤维细胞）。1 h后，将细胞悬液移入新的培养瓶中继续培养，每2日换液1次。

1.6 指标检测 1）HE染色法观察在体实验多裂肌形态学变化：多裂肌经4%多聚甲醛溶液固定72 h后，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋，连续切片，对切片行二甲苯脱蜡，乙醇梯度水洗。常规HE染色后再脱水、二甲苯透明、封片。光镜下观察多裂肌组织结构的变化。2）Western blotting 法检测 离体实 验 MyoD、CDK4、CyclinD和P57蛋白的表达：细胞稀释为2×105个/mL，以1×106/皿将细胞悬液接种到100 mm培养皿中，各皿随机分为空白血清组、模型血清组、电针“委中”血清组、抑制剂血清组（电针“委中”血清中加入PI3K抑制剂LY294002）。当细胞贴壁后弃去培养基，每皿加入对应血清的培养基，抑制剂组提前2 h加入50 μmol/L LY294002，继续培养1 d。1 d后提取细胞总蛋白，测定蛋白含量并进行蛋白变性，将提前制好的10%丙烯酞胺凝胶置于电泳槽中，Marker上样3 μL，其余蛋白上样10 μL，80 V电泳至浓缩胶与分离胶交界处后换为100 V电泳1 h，当嗅酚蓝条带距胶底约1 cm时停止电泳，换80 V电转75 min。含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h后，于4℃一抗孵育过夜，二抗孵育1 h后TBST洗3次（5 min/次），ECL显色并曝光。图像采集完毕后，使用Fluor Chem软件定量分析MyoD、CDK4、CyclinD、P57和β-actin的OD值，对各指标与内参吸光度比值进行统计分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。每组样本数据以（±s）表示，服从正态分布的数据组间差异用单因素方差分析，方差齐性时两两比较用LSD-t检验，方差不齐时采用Welch检验，不服从正态分布的数据采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠多裂肌HE染色形态学变化 见图1。结果显示：空白组可见规律排列、大小均匀的肌纤维，细胞核均匀分布在细胞周围；模型组可见大面积的肌纤维变性坏死区域，炎性细胞大量浸润，坏死区偶见未受损的肌纤维；电针“委中”组可见肌纤维坏死、降解形成的空泡结构以及炎性细胞浸润，变性坏死区明显减少，偶见直径大小不一的新生肌纤维。

2.2 电针对MyoD、CDK4、CyclinD、P57蛋白表达的影响 见图2和表1。Western blotting结果显示：与空白血清组比较，模型血清组、电针“委中”血清组和抑制剂血清组的MyoD蛋白表达量均显著升高 （P＜0.01）；与模型血清组对比，电针“委中”血清组MyoD蛋白表达量显著升高（P＜0.01）；且电针“委中”血清组MyoD蛋白表达量高于抑制剂血清组（P＜0.01）。与空白血清组对比，模型血清组、电针“委中”血清组和抑制剂血清组的CDK4和P57蛋白表达量均显著升高（P＜0.01）；与模型血清组对比，电针“委中”血清组CDK4蛋白表达量升高（P＜0.05），而P57蛋白表达量显著降低（P＜0.01）；与抑制剂血清组对比，电针“委中”血清组CDK4蛋白表达量高于抑制剂组（P＜0.05），而P57蛋白表达量显著低于抑制剂组（P＜0.01）。与空白血清组对比，电针“委中”血清组CyclinD蛋白表达量升高（P＜0.05），其他各组对比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠多裂肌形态结构（HE染色，400倍）

表 1 各组 MyoD、CDK4、CyclinD、P57 蛋白表达的比较（±s）

表 1 各组 MyoD、CDK4、CyclinD、P57 蛋白表达的比较（±s）

与空白血清组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型血清组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与抑制剂血清组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组 别MyoD CDK4 CyclinD P57空白血清组模型血清组电针“委中”血清组0.462±0.027 0.567±0.039 0.593±0.054 0.212±0.016 0.653±0.005** 0.783±0.067** 0.640±0.062 0.528±0.037**0.729±0.019**△△##0.870±0.089**△#0.709±0.054*0.353±0.032**△△##抑制剂血清组0.668±0.015** 0.766±0.063** 0.693±0.045 0.562±0.022**

图2 各组MyoD、CDK4、CyclinD、P57蛋白电泳条带图

3 讨 论

多裂肌是一组附着于棘突、椎板和横突之间的椎旁肌群，在腰部最为发达。腰多裂肌附着面积大、肌纤维含量丰富，能够产生强大的收缩力以维持腰椎的稳定性［9]。腰椎后路手术中，剥离和牵拉是引起多裂肌急性损伤的主要因素。近年来，运用针刺治疗骨骼肌急慢性损伤的研究日益增多，Yu等发现，电针足三里和阿是穴可显著促进腓肠肌钝挫伤后的肌肉再生［10]；Su等发现电针可促进糖尿病肌病患者及神经损伤后的肌肉修复［11]。本实验多裂肌HE染色结果显示，电针“委中”组肌纤维在同一时间点修复程度优于模型组，从形态学上说明电针“委中”可加快损伤骨骼肌再生修复。

电针血清源于血清药理学，已成为针灸学研究的一个新热点［12]。中医学认为“血”由精气化生，是构成人体的基本物质之一。《难经》有云“血主濡之”，故血和则“筋骨劲强，关节清利”。现代医学表明，血清中含有大量营养成分和生长因子等各种维持细胞生长的必须物质。“委中”为足太阳膀胱经的合土穴，《四总穴歌》记载“腰背委中求”。足太阳膀胱经脉从头走足，在背部形成两行夹脊循行，直达腰骶，下至腘窝合并于委中。其舒筋通络、行气活血的功效突出，又因“经脉所过，主治所及”的治疗理论，成为临床治疗腰部疾病的常用穴位。课题组前期在骨骼肌损伤修复方面进行了长期研究，发现电针“委中”穴可以促进多种生长因子的表达，减缓损伤局部的炎症反应，促进损伤的多裂肌良性修复［4-6]。

大量研究已证实电针可显著促进骨骼肌干细胞——肌卫星细胞的增殖，加速骨骼肌的修复［4，13]。MyoD是重要的生肌调节因子之一，处于激活、增殖状态的肌卫星细胞均有表达，因此，MyoD是反映肌卫星细胞增殖活性和骨骼肌再生能力的金标准［14-15]。Macaluso等研究发现，激活的卫星细胞可通过上调MyoD的表达以促进细胞增殖［16]。而细胞增殖的顺利进行与细胞周期密切相关，正常细胞周期是在正负因子调控下的同步过程；CDK4是细胞周期正调控的关键蛋白，其功能的激活主要依赖于细胞周期蛋白。Cyclin D是细胞周期蛋白亚型之一，与CDK4结合形成激酶复合物，进而实现正性调控作用［17]。研究发现，当CDK4和CyclinD表达同时增强，便可能诱导细胞提前进入S期，使细胞周期缩短从而加快增殖。然而，CDKs的活性可被细胞周期抑制蛋白 （CKI）所抑制。P57作为CKI的重要组成之一，是细胞周期的重要负调控蛋白。研究表明，P57能够竞争性的与大部分CDK-cyclin复合物结合从而抑制其活性，特别是G1期的 CDK4/6-cyclinD 复合物［18]。

本实验研究发现，模型血清组、电针“委中”血清组的MyoD、CDK4和P57蛋白表达量均显著高于空白血清组（P＜0.01），且电针“委中”血清组 MyoD和CDK4蛋白表达量高于模型血清组 （P＜0.01或P＜0.05），而P57蛋白表达量显著低于模型血清组（P＜0.01）。这表明损伤后的多裂肌启动自我修复功能，肌卫星细胞激活并进入周期性增殖状态，电针 “委中”血清在上调MyoD和CDK4蛋白表达的同时，下调P57蛋白的表达，加速细胞周期性增殖的进程。本实验中，电针“委中”血清组CyclinD蛋白表达量高于空白血清组 （P＜0.05），其他各组对比差异无统计学意义（P＞0.05），因CyclinD含量受到多种生长因子的调控而呈周期性变化，其高峰表达出现在G1期的中晚期［19]，推测此时可能并非CyclinD表达的高峰期，而电针血清有促进肌卫星细胞增殖高峰期提前的作用［20]，因此出现以上实验结果。PI3K-Akt是调控肌卫星细胞增殖的重要通路，Li等［21]发现，以 PI3K 特异性阻断剂 LY294002 阻断该通路后，肌卫星细胞的增殖能力明显下降。我们前期研究也发现，抑制剂血清组MyoD、p-Akt等蛋白表达明显下调，细胞增殖速度减慢［4]。本实验结果显示，与电针“委中”血清组相比，抑制剂血清组MyoD、CDK4蛋白表达量均降低（P＜0.01或P＜0.05），而P57蛋白表达量升高（P＜0.01），与上述结论相符，然而其机制为何有待进一步研究。

总之，电针“委中”血清可通过上调MyoD、CDK4的表达，并下调P57的表达，加速肌卫星细胞增殖的周期性进程，促进损伤多裂肌的良性修复。