赵登泽， 郑军△， 李林， 陈越， 谢珂， 郑卫红， 谭潇△

1三峡大学第一临床医学院、三峡大学肝胆胰外科研究所(湖北宜昌 443002)； 2三峡大学医学院、肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室(湖北宜昌 443002)

组织激肽释放酶(kallikreins, KLKs) 是一组丝氨酸蛋白酶，也是目前人类基因组上已知的最为庞大的蛋白水解酶基因簇。其编码基因定位于染色体19q13.3～13.4上，由15个成员组成，各个基因位点紧密连接、互不干扰、结构高度相似，编码对应15种蛋白质(KLK1～KLK15)[1]。KLKs广泛存在于人的体液和各种组织中，其中KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK11和KLK15在前列腺中表达，KLK10、KLK13、KLK14在乳腺中表达，KLK1、KLK10、KLK12在胰腺中表达，KLK5～KLK9、KLK11、KLK14在中枢神经系统中表达，KLK5、KLK7、KLK8及 KLK14在皮肤中表达[2]。近年来研究表明KLKs参与了机体的许多生理过程，如血压调节、激素调节、组织重塑、皮肤脱屑等[3]。同时也发现其在各种疾病的病理过程中起着重要作用，如许多皮肤病以及肿瘤的增殖、侵袭和转移等[4]。KLKs异常表达与多种疾病的相关性，使其越来越受到人们的重视。本文就KLKs在皮肤中的生理病理作用及其抑制剂在皮肤相关性疾病中的研究进展进行综述。

1 KLKs在皮肤中的生理病理作用

皮肤是人体最大的器官，是机体的第一道生理屏障，具有两个方面的屏障作用：一方面防止体内水份、电解质、其他物质丢失；另一方面阻止外界物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。到目前为止，至少发现9种KLKs(KLK1、KLK5～KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14)表达于皮肤中，这些KLKs的表达与皮肤的屏障功能密切相关[5]。正常人皮肤中丝氨酸蛋白酶活性主要来源于KLK5、KLK7和KLK14。KLKs能够保持健康皮肤的屏障功能主要通过以下3个方面实现：(1)通过脱皮或角质细胞增殖来调节表皮的厚度和更新速度；(2)通过调节脂质加工酶和激活角质细胞表面的蛋白酶活化受体(protease activated receptor，PAR)来调节富含脂质屏障的通透性[6]；(3)通过加工肽和细胞因子前体来诱导皮肤抗菌作用和先天性免疫应答[7]。研究表明，KLKs在皮肤中的蛋白级联反应中起着重要作用，如皮肤中KLK5能激活KLK7前体,还能激活其自身和KLK14的前体,而KLK14虽然不能自身激活却能激活KLK5前体[8]。这些KLK之间的协同作用及精细调节共同维持了皮肤的正常生理功能。

研究发现KLKs表达异常与多种皮肤相关性疾病密切相关，以以下几种皮肤病尤为明显：(1)银屑病，又名牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，病程长，复发率高，有的终生不愈。Komatsu等[9]发现在银屑病患者皮肤中KLK6、KLK10和KLK13较正常人明显升高，且未经治疗的银屑病患者血清中KLK6、KLK10和KLK13的表达水平与银屑病的面积和严重程度显著相关。说明这几个KLK是银屑病预后判断的生物学标志物，也可能是其治疗的潜在靶点。(2)黑色素瘤，作为病死率最高的皮肤恶性肿瘤，研究发现在其进展过程中，KLK6、KLK7、KLK8和KLK13均呈现高表达且具有协同性，同时发现KLK7过表达能够促进E-钙黏蛋白的表达下调以及MCAM/CD146的上调从而使肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强，使其从增殖型转变为侵袭型，研究表明KLK7蛋白高表达与黑色素瘤预后不良具有显著相关性[10]。(3)特应性皮炎，其发生、发展的关键因素之一是皮肤屏障功能的紊乱或丧失[11]。研究发现特应性皮炎患者角质层中KLKs活性升高,特别是KLK7尤为明显[12]。Komatsu等[13]通过ELISA也检测到特应性皮炎患者血清中KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK13和KLK14较正常人皮肤均显著升高，尤其是KLK7较其他升高更为明显，表明KLKs与特应性皮炎具有显著的相关性。(4)罕见病瑟顿综合征(Netherton syndrome，NS)，它是一种因SPINK5基因缺失而导致的KLKs天然抑制剂LEKTI的表达缺乏而引起的遗传性皮肤病,LEKTI能抑制KLK5、KLK7和KLK14的活性，其缺失将导致这些KLKs活性增加从而引起广泛的皮肤脱屑、全身性红皮症以及竹节样毛发等[14]。由此可见，KLKs参与了多种皮肤相关性疾病的发生与发展并在此过程中起到了极其重要的作用。

2 KLKs抑制剂的研究进展

目前临床上对于NS、特应性皮炎、银屑病等皮肤病，多采用润肤膏、局部外用糖皮质激素、光疗、大剂量静脉注射免疫球蛋白等治疗方法，缺乏特异性的药物，而KLKs作为皮肤相关疾病潜在的治疗靶点，越来越受到人们的重视。近几十年来，国内外很多学者致力于寻找具有特异性、高效性的KLKs抑制剂应用于皮肤相关疾病的临床治疗中，以期改变目前的治疗困境。目前发现的KLKs抑制剂主要有以下几大类:

2.1 金属离子抑制剂 二价金属阳离子(Zn2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+等)是KLKs的主要内源性抑制剂。多种金属离子参与了KLKs活性的调节，目前研究较多的是Zn2+离子，其被发现在微摩尔每升浓度范围内能够抑制几种KLKs(KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK7、KLK8、KLK10、KLK12、KLK14)的活性[15]。Debela[16]等发现Zn2+与KLK5的结合能够使其构象发生改变从而使其活性被抑制，其指出在不同pH值下Zn2+对KLK5抑制常数(Ki)不同(pH=7.0，Ki=8.0±1.0 μmol/L；pH=8.0，Ki=2.0±0.3 μmol/L)；Debela等[17]在另一研究中发现，低浓度的Zn2+能够非竞争性抑制KLK7的活性，同时还发现低浓度的Cu2+也能抑制KLK7的活性；另外，Zn2+还能降低KLK8及KLK14的活性[18-19]。综上所述，二价金属阳离子在KLKs的活性调节上起着重要作用，目前已有相关含二价金属离子的药品在临床上用于皮肤相关性疾病的治疗，并具有良好的临床疗效，如含氧化锌的膏状绷带[20]。相信随着研究的进展，会有越来越多金属离子抑制剂应用于皮肤疾病的临床治疗中。

2.2 内源性蛋白质抑制剂 (1)丝氨酸蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)是大小约为33～46 kD的丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶大分子抑制剂[21]，其抑制机制是通过结合靶蛋白，形成稳定的共价化合物导致其构象改变，从而使活性位点变形[22]。研究发现Serpins可以抑制皮肤中的部分KLKs，如α1-抗胰蛋白酶(α1-Antitrypsin，α1-AT)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1-Antichymotrypsin，α1-ACT)可以抑制KLK7，抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ，ATⅢ)可以抑制KLK14，α2-抗纤维蛋白溶酶(α2-Antiplasmin，α2-AP)和蛋白酶C抑制剂(protein C inhibitor， PCI)可以抑制KLK5、KLK7～8和KLK14[15, 23]。但这类抑制剂对热不稳定、分子量大、生物利用度低限制了其进一步临床应用研究。(2)Kazal型抑制剂。Kazal抑制剂是由Kazal等[24]在1948年从胰腺分泌物中提取到的含有58个氨基酸的肽类物质，对皮肤中KLK具有抑制作用，其抑制情况如表1所示[25]。该类抑制剂的主要代表物质是由SPINK5基因编码的LEKTI蛋白(Lympho-epithelial Kazal type related inhibitor)，LEKTI的主要结构包括15个片段(称为D1～D15)，显示对KLK5、7和14具有特异性的抑制作用，其中D6片段可以抑制KLK5和KLK7(IC50分别为0.06 μmol/L和0.34 μmol/L)，D9、D12片段可抑制KLK5和KLK14(Ki在3～10 nmol/L之间)[26-28]。LEKTI表达缺乏可引起KLK5、KLK7和KLK14的活性增加，从而增强桥粒芯蛋白的降解而使皮肤脱落，进而导致一种罕见的常染色体隐性皮肤病NS，其特点是广泛的皮肤脱屑、炎症、过敏表现以及竹节样毛发[29]。关于NS的治疗目前还没有足够特异性的药物，通过合成抑制剂抑制皮肤中KLKs的活性而达到治疗目的已成为国内外的研究热点，如针对KLK5合成的LEKTI蛋白片段D6[30]。另外，还有两种Kazal型抑制剂被发现在KLKs活性的调节中起着至关重要的作用。一种是由Spink9基因编码的LEKTI-2型抑制剂，其可选择性抑制KLK5，但对KLK7和KLK14等其他几种蛋白酶无抑制作用， 因SPINK9主要表现在手、脚底部及胸腺的颗粒层而在其他组织中表达水平非常低，因此被认为是脚湿疹的一个关键因素[31]。另一种Kazal型抑制剂为SPINK6，在不同身体部位的皮肤中差异性表达，以掌跖部位皮肤的表达水平最为突出，并可从足底皮肤角质层中提取，表现出对KLK5、KLK7和KLK14的抑制作用，其在特应性皮炎及牛皮癣病灶中表达减少[32]。虽然这类抑制剂在体外实验中通常具有良好的抑制效果与特异性，但它们与Serpins类似，其自身的蛋白质属性导致其稳定性较差，应用具有局限性。

表1 Kazal型抑制剂对KLK的抑制作用

2.3 天然肽和蛋白质类抑制剂 这类抑制剂主要是从微生物、植物和动物中提取出来的各种肽和蛋白质，主要包括三大类：肽醛、Kunitz型抑制剂和缩肽。(1)肽醛(peptide aldehydes)类抑制剂是以亮肽素(leupeptin)、抗痛素(antipain)以及向日葵胰蛋白酶抑制剂-1(sunflower tryps ininhibitor-1，SFTI-1)等为代表的抑制剂。其中亮太素和抗痛素已被证实对KLK5、KLK8及KLK14有抑制作用，但其缺点是是这类抑制剂抑制效果与特异性较差[8, 16, 19]。向日葵蛋白酶抑制剂-1(SFTI-1)是从向日葵种子中提取出来的含有14个氨基酸残基的环肽胰蛋白酶抑制剂，它是一种有效浓度在亚纳摩尔每升范围的丝氨酸蛋白酶抑制剂，虽然其抑制效率高但其生物利用度低[33]。(2)Kunitz型抑制剂是以大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)为代表的蛋白质类抑制剂。SBTI是由181个氨基酸残基组成的多肽链，其3D折叠结构由两个二硫桥稳定，该蛋白质对KLK5和KLK14有抑制作用[25]。(3)缩肽(depsipeptides)类抑制剂是从细菌中分离出来的KLK7的抑制剂(IC50介于0.4～6 nmol/L之间)，其能够抑制多种蛋白酶，如抑制胰凝乳蛋白酶和人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶等[34]。

2.4 天然杂环衍生物类抑制剂 这类抑制剂主要以异香豆素为代表。异香豆素是一类天然多酚化合物，它们存在于多种植物中，并在药理学活性中体现出了巨大的价值。Teixeira等报道[35]从天然化合物中得到了3种异香豆素类抑制剂：paepalantine、8,8′-paepalantine 与 vioxanthin，并发现它们可以靶向性抑制KLK5(IC50=367.4 μmol/L、IC50=72.9 μmol/L和IC50=53.7 μmol/L)和KLK7(IC50=165.8 μmol/L、IC50=112.4 μmol/L和IC50=135.3 μmol/L)。虽然这3种化合物对KLKs的抑制能力都相对较弱，但其为KLKs抑制剂的研究与开发提供了新的思路与方向。

2.5 合成肽及其衍生物类抑制剂 氯甲基酮肽及向日葵胰蛋白酶抑制剂-1(SFTI-1)衍生物是这类抑制剂的代表。氯甲基酮肽是KLKs共价抑制剂，其中TPCK(甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮)、AAF-CMK、Suc-AAPF-CMK为KLK7的非选择性不可逆抑制剂，TCPK可以在微摩尔每升浓度下不可逆地抑制KLK7[17]。Shariff等[36]通过生物学手段合成了两种SFTI-1的衍生物SFTI-I10G和SFTI-I10H，并且通过体外实验证明了这两种衍生物均为KLK5的抑制剂，其中SFTI-I10H的IC50为0.14 μmol/L，较SFTI-I10G强。Chen等[37]在此基础上又合成了5个SFTI-1的衍生物，结果发现其中化合物6对KLK5[(IC50=(24±2)nmol/L)]、KLK7[(IC50=(534±29)nmol/L)]、KLK14[(IC50=(23±1)nmol/L)]均表现出强抑制作用，随后他们将化合物6局部应用于体外皮肤模型上，发现它对皮肤角质层下的蛋白酶具有抑制作用。证实了SFTI-1衍生物在治疗皮肤病上具有潜在的价值。

2.6 非肽类合成衍生物类抑制剂 这类抑制剂大多具有良好的生物利用度，其自身化学性质也相对稳定，包括香豆素-3-羧酸酯衍生物(coumarin-3-carboxylate derivative)、三氮唑衍生物(triazoles derivatives)、喹唑啉酮衍生物(quinazolinone derivative)、异甘露醇衍生物(isomannide derivative)和基于吡啶咪唑啉酮(pyrido-imidazodiazepinone)为骨架的杂环化合物等。香豆素-3-羧酸酯衍生物是一类小分子抑制剂，其具有良好的选择性、容易合成和强抑制能力，其3-和6-位置的化学修饰对其特异性极度敏感。Tan等[38]通过体外酶学研究以及利用Tg-hKLK5小鼠作为NS的模型用于原位酶谱分析，验证了这类衍生物在纳摩尔每升浓度范围内对皮肤中KLK5、KLK7及KLK14有抑制作用，并发现适当地改变其结构可进一步优化这些化合物。同时该团队在三氮唑衍生物类抑制剂中也有新的发现，他们通过高通量筛选出了6种1,2,4-三唑衍生物小分子抑制剂，证明了其在纳摩尔每升浓度范围内对皮肤中KLK5、KLK7及KLK14均有抑制作用，同时对健康人角质细胞没有细胞毒性，这说明三氮唑衍生物可能成为NS及其他皮肤病潜在的治疗药物[39]。此外，该研究团队通过计算机辅助药物设计发现了另一类KLKs抑制剂，喹唑啉酮衍生物，证明了它是KLK7的可逆性抑制剂(IC50=25 μmol/L)[40]。异甘露醇衍生物是由异甘露醇衍生的非肽类抑制剂，Freitas等[41]在2012年发现两个异甘露醇衍生物9g和9j为KLK5和KLK7的竞争性抑制剂，之后该研究小组通过引入新的结构，发现了一些对KLK5和KLK7的抑制能力更强的异甘露醇衍生物[42]。基于吡啶咪唑啉酮为骨架的杂环化合物是一类抑制效果和特异性较高的KLKs抑制剂，Arama等[43]从65个杂环衍生物库,包括咪唑并[1,2-a]吡啶(Imidazo[1,2-a]pyridine)和1,3-噻唑衍生物(1,3-thiazole derivatives)进行初始筛选，发现吡啶咪唑啉酮衍生物1a为KLK7的可逆的竞争性抑制剂(IC50=57 μmol/L，Ki=50 μmol/L)。随后他们将2-甲基苯基取代基替换为3,4-二甲氧基苯基形成化合物1o，并发现其抑制效果较化合物1a略有增加(Ki=27 μmol/L)。这一研究结果为以吡啶咪唑啉酮为骨架来开发高选择性和竞争性的KLK7抑制剂提供了新的方向。

3 展望

综上所述，通过对KLKs的不断研究，发现多种KLKs在皮肤中表达，并且在皮肤相关性疾病的发生发展中起着极其重要的作用。而目前对于临床上大多数的皮肤性疾病，如NS、银屑病等，还没有特异性的药物。因而通过研究开发靶向性抑制剂来抑制皮肤中的KLKs活性从而治疗这类皮肤病已成为近年来研究的热点，并且取得了较为丰硕的成果，部分化合物表现出了较强的抑制效果，在对部分经典的抑制剂进行深入的结构修饰及改造后，还获得了一些高效且选择性和特异性均较强的化合物。目前这些抑制剂大多还处于基础研究或临床前研究状态，缺乏相应的临床数据。相信随着KLKs研究的不断深入, 将会有更多抑制效果更强、特异性更高、生物利用度更好、化学性质更稳定、毒副作用更低的抑制剂出现，为临床上皮肤相关性疾病的治疗提供更为广泛的选择。