邱立东， 黄华泥， 徐五星， 任易， 陈军， 陈丽峰， 周菁△

1赤壁市人民医院检验科(湖北赤壁 437300); 2武汉市肺科医院检验科(湖北武汉 430030)

卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)是由卡介菌培养，经破碎后由酚抽提所得的制品，主要成分是多糖和核酸[1]。BCG-PSN是获得国家食品药品监督管理局批准的免疫调节剂[2]。通常用于皮肤炎、哮喘等一些过敏性疾病的治疗[3]。近年来，BCG-PSN在临床上使用量在不断增加，其作用日益受到重视。目前临床BCG-PSN采用肌肉注射的方式给药，疗程一般是1个月，这种给药方式让患者感到不适。自2017年3月至2018年5月，本研究探讨了一种新的给药途径，即采用微针贴片技术，经皮投递BCG-PSN粉剂，以代替常规肌肉注射给药达到治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 BCG-PSN粉剂 (国药准字S33020001，多糖含量70%～80%，核酸含量11%～16%，蛋白质<0.5%)，由浙江万晟药业有限公司馈赠。透明质酸钠粉剂(HA, Lifecore 024477，024812)，磺酰罗丹明B (SRB，Sigma，3520421)，三聚二甲硅氧烷(PDMS)微针模具由湖北大学生命科学学院惠赠。BALb/c小鼠(5～6周龄)，SPF级别，标准饲养，许可证号：42000600020466购自湖北省疾病控制中心。BCG (D2PB302)于本实验室保存，罗氏培养基(深圳贝索，20171018)。抗体FITC-anti-CD4,PE-anti-γ干扰素(IFN-γ), APC-anti-肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及Cytofix/Cytoperm buffer均购自BD(Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 微针制备 用蒸馏水分别配制10%和20%(w/v)的HA， 取20% HA加到PDMS微针模具中，4℃ 1 500 r/min水平离心10 min；将模具取出旋转180°放置，4℃ 2 200 r/min水平离心10 min，反复2次；将模具取出旋转180°放置，4℃ 3 000 r/min水平离心15 min，反复两次；去除模具表面多余的HA，加入10% HA，4℃ 2 000 r/min离心10 min。将模具置于负压罐中抽干水分。

1.2.2 结构观察 称取250 mg SRB与蒸馏水混匀后，按上述方法制备SRB染色后的微针贴片。取出干燥后的微针贴片，用石蜡包埋后，切割制片，显微镜下观察中空结构。

1.2.3 药粉装填检测 按2.1制备微针，SRB粉剂倒入制备好的中空微针中，4℃ 3 000 r/min水平离心10 min，将模具取出旋转180°放置，继续离心10 min，如此反复离心3次，使粉末进入微针中空部分，并去除模具表面多余的干粉；再加入15%的透明质酸钠盐溶液，制成贴片后干燥脱模；取出微针贴片(1 cm×1 cm)，在共聚焦显微镜(Leica DM RXA,Germany)下观察SRB粉剂。

1.2.4 载药量测定 准确称取1 mg BCG-PSN粉剂，用蒸馏水倍比稀释，在微量分光光度计Nanodrop 8000 (Thermo scientific,USA)上测定260 nm吸光度，建立标准曲线。选取6张制备好的BCG-PSN微针贴片，每张贴片随机剪取9根微针，溶于蒸馏水中，260 nm 测定吸光度，并根据标准曲线计算载药量。

1.2.5 小鼠实验 18只5周龄雌性BALB/c小鼠按照随机分组法分成3组，每组6只，分别为BCG-PSN微针处理组、肌肉注射组和盐水(0.9% NaCl)对照组。BCG-PSN微针处理组小鼠背部去毛后，用微针贴片给药(87 μg)，肌肉注射组肌肉注射BCG-PSN 35 μg/100 μL, 盐水对照组肌肉注射100 μL生理盐水。连续给药1周。

1.2.6 细胞因子检测 给药后2周，分别采取各组小鼠的眼眶静脉血，收集外周血单个核细胞，培养于DMEM (Sigma)中；培养基添加 10% 胎牛血清, 100 U/mL 青霉素, 100 mg/mL 链霉素 (Gibco)；培养2 h 后，调整细胞密度为2×106·mL-1，加入BCG膜蛋白提取物[4-5]，终浓度为5 μg/mL，37℃于5% CO2环境刺激培养16 h；加入蛋白转运抑制剂Golgiplμg (BD)，继续培养5 h；收集细胞，加入FITC-anti-CD4 抗体对细胞表面染色，再加破膜固定剂Cytofix/Cytoperm buffer (BD)，洗涤后加入PE-anti-IFN-γ 和 APC-anti-TNF-α抗体(BD Bioscences)进行胞内染色，用流式细胞仪检测阳性细胞 (Beckman, USA)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件,进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微针及微针贴片 制备好的微针阵列贴片有64根微针(8×8)，微针高度为500 μm，底部直径为250 μm(图1-A)。SRB染色的微针制成石蜡切片后，在显微镜下可观察到中空结构(图1-B)。

A：8×8个微针阵列；B：SRB染色的微针制成石蜡切片后，在显微镜下观察，箭头所指是微针的中空结构(10×)

2.2 粉剂填装观察 将SRB粉末装填进微针中，共聚焦显微镜下可观察到SRB粉剂填充到中空结构中(图2-A)。从微针底部观察，也可见SRB粉末已充满微针中空结构(图2-B)。

2.3 微量分光光度计测定载药量 BCG-PSN溶液倍比稀释后在260 nm 测定吸光度，绘制标准曲线(图3-A)，分别从6张贴片上随机剪取微针，溶解后测定吸光度，根据标准曲线计算每根微针可装载BCG-PSN粉剂约1.35 μg(图3-B)。

2.4 细胞因子反应 各组小鼠在处理后2周检测外周血T细胞细胞因子IFN-γ和TNF-α，可见BCG-PSN微针处理组 IFN-γ和TNF-α水平均显著高于盐水对照组(P=0.0087,P=0.032)。肌肉注射组IFN-γ也显著高于盐水对照组(P=0.014)，但TNF-α与盐水对照组相比差异无统计学意义。BCG-PSN微针处理组IFN-γ和TNF-α水平虽然也高于肌肉注射组，但差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

A：SRB粉末装载后，充满了微针的中空部分，左图为可见光观察微针，右图为荧光观察SRB分布情况；B：从微针底部观察SRB填充情况，上层左图为可见光观察微针底部，上层右图为荧光观察微针底部，下层为相应的3D合成图。标尺显示的长度是250 μm

图2共聚焦显微镜下观察SRB粉剂填充情况

A：BCG-PSN溶液在260 nm测定的吸光度标准曲线；B：从6张微针微针贴片上随机剪取9根微针，计算单根微针的平均载药量，实验重复3次

项目nIFN-γTNF-α盐水对照组60.089±0.0020.098±0.008肌肉注射组60.117±0.011∗0.102±0.010BCG-PSN微针处理组60.138±0.023∗∗0.121±0.012∗

与盐水对照组比较*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

一些研究表明，BCG-PSN有类似结核杆菌的抗原性，可增强Th1免疫反应[6]。卡介菌多糖核酸的作用机制是能增强机体细胞免疫功能，调节机体内的细胞免疫、体液免疫，并激活T淋巴细胞，使之释放各种淋巴因子[7]。BCG-PSN可以发挥抗肿瘤细胞作用[8]，充当疫苗佐剂[9]，在治疗口腔扁平苔藓和慢性自发性荨麻疹方面均有一定疗效[10-11]。BCG-PSN的免疫调节作用在临床上得到了广泛的使用，但由于治疗周期长，常规的给药方式往往带来诸多不便。微针给药方式是近年来兴起的一种技术[12-13]，具有无痛、无皮肤炎症、无生物有害废料等优势[14-15]。早期的微针是不溶性微针，药物是包被在微针表面，容易失活或污染，目前微针以可溶性微针为主，药物溶解在微针中，随微针溶解在皮内[16-17]。可溶性微针使微针对皮肤的刺激更小，已被广泛用于投递药物或疫苗的研究[18-19]。

本研究通过小鼠模型探讨可溶性微针经皮投递BCG-PSN粉剂的免疫调节效应。实验所用的是500 μm长的中空微针，可以很好地装载BCG-PSN粉剂，平均一个微针贴片的载药量可达87 μg，在小鼠模型中，与盐水对照组相比，BCG-PSN微针处理组可以有效刺激外周血T细胞IFN-γ和TNF-α的产生；肌肉注射组也可显著提高外周血T细胞IFN-γ的产量(P<0.05)，但其刺激效果不如BCG-PSN微针处理组；此外，肌肉注射组不能使外周血T细胞TNF-α的产量增加。虽然BCG-PSN微针处理组与肌肉注射组在刺激IFN-γ和TNF-α产量上没有显著性差异，但相对盐水对照组而言，BCG-PSN微针处理组的免疫调节效果要好于肌肉注射组，这是由于皮肤中具有丰富的免疫细胞，可以更好地产生免疫刺激效果[20-21]。本实验采用粉剂给药，可以延长微针贴片的保存期，并在皮肤内缓慢释放，更好地发挥免疫调节效果[22]。微针贴片装载BCG-PSN粉剂，无疼无刺激，方便携带，患者可以自行给药，具有很大的便利性，为临床给药提供了一种新的选择途径。目前临床肌肉注射BCG-PSN剂量为0.35 mg/次，远远高于单片微针贴片所带的载药量，虽然相同剂量的皮肤给药效果优于肌肉注射，但在人体微针贴片给药时，还需进一步研究具体的给药量，以达到临床治疗的需要。