肖 妍 刘芸宏 高贵田,2 曹 凡 马燕萍 赵武奇 雷玉山

(1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119；2.陕西省猕猴桃工程技术研究中心，陕西 西安 710404；3.陕西省农村科技开发中心，陕西 西安 710054)

猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的细菌性病害[1]，严重影响猕猴桃产业的发展。目前，该病菌的检测主要采用PCR技术，但是常规的PCR技术不能区分样品中病原菌的生活状态，在对活菌DNA进行扩增的同时，也会扩增自由状态的DNA或者死菌的DNA[2]，检测产生假阳性，无法确定Psa的生活状态，无法对溃疡病的发生趋势作出科学预测，也无法对消毒、防治效果做出科学判断。

叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)是一种能和DNA共价交联的荧光染料。PMA可以通过死菌损伤的细胞膜进入死菌细胞，并且光照可使PMA的光敏基团转化为氮宾自由基，与死菌DNA发生共价交联，从而抑制后续DNA扩增[3-6]；活菌细胞膜完整，PMA不能进入细胞内；剩下的少量游离在溶液中的PMA则可与溶液中的水分子结合形成羟胺(—NH—OH)，失去与DNA结合的活性；PMA-qPCR技术就是利用这一特性，实现了只扩增活细胞的DNA，而不扩增死细胞的DNA[4]。

近年来，PMA-qPCR技术已被广泛应用于多种微生物活死菌的鉴别检测[7]，但该技术用于鉴别陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌仍鲜见报道。于小龙等[8]建立的PMA-qPCR方法，能有效对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测；温书香等[9]通过优化PMA处理条件，实现了对结核杆菌活菌的快速检测；於颖等[10]在PMA浓度30 μg/mL下，曝光5 min，可实现对金黄色葡萄球菌活菌筛选的作用。

世界Psa主要分为三大类群，中国流行的猕猴桃溃疡病的Psa与最近在意大利、新西兰、西班牙、法国、葡萄牙等国流行的Psa为同一类群[11]。由于其同属的Pseudomonassyringaepv.theae和Pseudomonasavellanae与Psa的亲缘关系非常近，常规的分子标记技术很难将它们区分开[12]。Gallelli等[13]根据猕猴桃溃疡菌的hrpW基因保守区，设计P3F/P5R1引物，不仅能区分Pseudomonassyringaepv.theae和Pseudomonasavellanae，也可以准确区分出强致病力菌株(Psa-V)与弱致病力菌株，朱丹等[14]克隆了陕西猕猴桃优势Psa的hrpW基因保守区，其序列与Psa-V同源性为99%。

因此本研究拟利用陕西猕猴桃优势Psa的hrpW的P3F/P5R1为引物，建立PMA-qPCR检测方法，研究PMA浓度、暗孵育时间及曝光时间等对Psa扩增的影响，并将死菌和活菌按一定的比例混合，对PMA-qPCR方法在实际检测中的可行性进行分析。为陕西猕猴桃溃疡病的快速检测、准确诊断及病情预测提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)：为陕西猕猴桃溃疡病优势病原菌[15]，西北农林科技大学植保学院黄丽丽教授惠赠；

PMA：美国Biotium公司；

Psa质粒标准品：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒、即用PCR扩增试剂盒：上海生工生物工程有限公司；

SYBR Green I试剂盒：天根生化科技有限公司；

卤素灯：500 W，飞利浦灯具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Psa菌悬液的制备 挑取Psa单菌落于King’s B液体培养基，24 ℃、190 r/min恒温震荡12 h，无菌水调节菌悬液浓度为1×107CFU/mL。

1.2.2 Psa菌膜损伤时间的确定 吸取500 μL菌悬液于1.5 mL的离心管中，沸水浴(98.3 ℃)分别处理10，11，12，13，14，15 min后立即在冰上冷却至室温，对照组未经沸水浴处理。吸取100 μL涂布于King’s B固体培养基上，24 ℃培养，3 d后统计单菌落数，无菌落生长视为全部是死菌，该时间为膜损伤菌的处理时间。

1.2.3 DNA提取 吸取500 μL菌液，8 000 r/min离心2 min 弃上清，按照DNA Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒的说明书提取DNA。

1.2.4 qPCR检测 qPCR引物根据Gallelli等[13]，修改如下，引物序列为：GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG和CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGA-C，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应总体系为10 μL，DNA模板1.0 μL，SYBR PCR premix 5.0 μL，引物P3F、P5R1各0.6 μL，ddH2O补足至反应总体积。反应程序为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，72 ℃退火20 s，30个循环，72 ℃延伸20 s。

1.2.5 PMA处理的条件

(1)PMA工作液的制备：1 mg PMA于8 000 r/min离心2 min，加入20%二甲基亚砜(DMSO)溶液200 μL充分溶解，得到5 μg/μL PMA储备液，于-20 ℃避光保存。

(2)抑制死菌扩增的PMA最小浓度：分别吸取6份膜损伤的死菌悬液500 μL于1.5 mL离心管，加入PMA，使PMA的终浓度分别为0，90，95，100，105，110 μg/mL，颠倒混匀，暗孵育8 min，将样品置于冰上，离心管口朝上，置于距样品20 cm的500 W卤素灯下，曝光处理20 min，提取样品DNA，用qPCR检测，从而确定能够完全抑制死菌扩增的PMA最小浓度。

(3)不影响活菌扩增的PMA最大浓度：吸取4份活菌悬液500 μL于1.5 mL离心管中，加入PMA，使PMA的终浓度分别为0，105，110，120 μg/mL，颠倒混匀，暗孵育8 min，将样品置于冰上，离心管口朝上，置于距样品20 cm 的500 W卤素灯下，曝光处理20 min，提取样品DNA，用qPCR分别检测，研究不抑制活菌扩增的PMA最大浓度。

(4)暗孵育时间的优化：分别吸取5份膜损伤的死菌悬液500 μL于1.5 mL离心管，加入确定的最佳PMA工作液浓度，分别暗孵育5，6，7，8，9，10 min，将样品置于冰上，离心管口朝上，置于距样品20 cm的500 W卤素灯下，曝光处理20 min，未加PMA的样品作为阳性对照，提取DNA，用qPCR检测，研究完全抑制死菌扩增的最佳暗孵育时间。

(5)曝光时间的优化：分别吸取6份膜损伤的死菌悬液500 μL于1.5 mL离心管，用确定的最佳PMA工作液浓度和最佳暗孵育时间进行处理，将样品置于冰上，离心管口朝上，置于距样品20 cm的500 W卤素灯下，分别曝光处理5，10，15，20，25 min，未加PMA的样品作为阳性对照，确定能够完全抑制死菌扩增的最佳曝光时间。

(6)PMA对不同比例活菌/死菌样品的检测效果：将培养至107CFU/mL的活菌和死菌按照表1进行混合，经合适条件的PMA处理提取DNA，进行PMA-qPCR反应，以未加PMA处理的样品作为对照。

表1 不同比例的活死菌样品Table 1 Proportion of different live and dead bacteria

1.2.6 标准曲线的建立 取已知浓度的Psa质粒标准品(由生工生物工程〔上海〕股份有限公司完成)，根据式(1)换算成基因拷贝数。

(1)

式中：

A——质粒DNA拷贝数，拷贝/μL；

C——DNA浓度，ng/μL；

M——片段大小；

NA——阿伏伽德罗常数，6.02×1023。

将Psa质粒标准品10倍梯度稀释至101，进行荧光定量PCR反应，以拷贝数对数值和所得Ct值为横、纵坐标建立标准曲线。

1.2.7 PMA-qPCR的灵敏度 菌液10倍梯度稀释至101，经合适条件的PMA处理提取DNA，进行PMA-qPCR的灵敏度分析。

1.2.8 猕猴桃枝条样品活菌检测

(1)枝条样品的染菌：取无菌的猕猴桃枝条，切成25 g 的小块，碾碎后放入无菌均质杯中，加入225 mL无菌水，8 000 r/min均质2 min，制成样品匀液。分别加入101～107CFU/mL的溃疡菌活菌悬液，作为人工染菌的样品。

(2)采用合适条件的PMA处理提取DNA，进行PMA-qPCR检测，根据标准曲线得到基因拷贝数，与平板计数的结果进行比较。

1.2.9 数据分析 采用DPS 7.05对试验数据进行显著性差异检验，P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 Psa膜损伤时间的确定

本试验采用食品上较常使用的高温灭菌方式制备死菌悬液[16]。菌悬液浓度为1×107CFU/mL，热处理不同时间，稀释一定浓度后涂布，24 ℃培养3 d，计数结果如表2 所示，热处理时间越长，对活菌的灭活效率越高，当膜损伤时间为13 min时，无菌落生长，因此，以13 min的沸水浴处理作为活菌的全部致死时间。

表2 时间对菌液灭活效率的影响Table 2 Effect of heat-treatment time on sterilizing rate

2.2 PMA处理条件的确定

2.2.1 PMA浓度的优化

(1)抑制死菌扩增的PMA最小浓度：由图1可知，随着PMA浓度的增大，Ct值逐渐增大，PMA的浓度为100 μg/mL时，Ct值增大比较小，当PMA浓度为105 μg/mL 时，对死菌DNA扩增抑制达到最大，PMA浓度为110 μg/mL时，Ct值几乎无变化，与PMA浓度为105 μg/mL相比，无显著性差异(P>0.05)，因此，确定抑制死菌DNA扩增最小PMA浓度为105 μg/mL。

PMA是一种能和死菌DNA共价交联的荧光染料，活菌的完整细胞膜可阻止PMA进入，从而达到检测活菌效果。但是，PMA浓度过高可能对活菌的细胞产生影响，导致假阴性的检测结果[17]。赵丽青等[18]在PMA浓度2 μg/mL下，500 W卤素灯曝光15 min可达到检测金黄色葡萄球菌活菌的目的。曹梦琪等[19]在PMA浓度15 μg/mL 下，650 W卤钨灯曝光5 min，可达到检测青枯菌活菌的目的。於颖等[10]在PMA浓度30 μg/mL下，650 W卤素灯曝光5 min可达到筛选金黄色葡萄球菌活菌的作用，并且试验中的菌悬液浓度均在108CFU/mL。本研究得到的Psa的最佳PMA浓度为105 μg/mL，菌悬液浓度为107CFU/mL。细菌的细胞膜差异很大，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌的细胞壁与细胞膜薄，对PMA的通透性好[20]，PMA使用浓度应该较低，但本研究得到的Psa的最佳PMA浓度与已有文献相差较大，可能与陕西猕猴桃优势病原菌本身对外界环境的抵抗能力有关，其对PMA产生抵抗的详细机理还需更深层次的探究。

图1 PMA浓度对膜损伤菌的影响Figure 1 Effect of PMA concentration on heat-treated bacteria

(2)不影响活菌扩增的PMA最大浓度：由图2可知，活菌DNA的Ct值随PMA浓度的增大而增大，PMA浓度为105 μg/mL时，与未加PMA的Ct值无显著性差异(P>0.05)，说明此浓度不会对活菌DNA的扩增产生较大影响，但是当PMA使用浓度>105 μg/mL时，与未加PMA的Ct值有显著性差异(P<0.05)，说明PMA浓度>105 μg/mL对活菌有一定的影响，因此，选择PMA浓度为105 μg/mL作为不影响活菌扩增的PMA最大浓度。

2.2.2 暗孵育时间的确定 由图3可知，随着暗孵育时间的延长，Ct值逐渐增大，暗孵育时间为7 min，Ct值增大比较小，当暗孵育时间延长至8 min，对死菌DNA扩增抑制达到最大，暗孵育时间>8 min，Ct值几乎无变化，与暗孵育时间8 min相比，无显著性差异(P>0.05)，8 min 的暗孵育时间可完全抑制死菌DNA扩增，因此确定最佳的暗孵育时间为8 min。

图2 PMA浓度对活菌的影响Figure 2 Effect of PMA concentration on live bacteria

抑制膜损伤菌DNA扩增除PMA浓度外，最佳的暗孵育时间也至关重要。PMA在光照条件下，与水分子结合生成羟胺，羟胺不能和DNA分子结合，从而无法抑制死菌的DNA，因此，在样品中加入PMA要避光处理合适的时间，而暗孵育时间的长短受样品菌浓度、PMA浓度、细胞膜结构等因素影响。结果表明，8 min的暗孵育时间可充分使PMA与DNA结合，曝光处理后与DNA结合形成不可逆的共价交联结构，抑制死菌DNA扩增。未与DNA结合的PMA曝光时可与水分子反应生成羟胺而失去活性[21-22]。

图3 暗孵育时间对膜损伤菌的影响Figure 3 Effect of incubation time on heat-treated bacteria

2.2.3 曝光时间的确定 由图4可知，随着曝光时间的延长，Ct值逐渐增大，曝光时间为15 min，Ct值增大比较小，当曝光时间延长至20 min，对死菌DNA扩增抑制达到最大，曝光时间为25 min，Ct值几乎无变化，与曝光时间20 min相比，无显著性差异(P>0.05)。因此，20 min 的曝光时间可完全抑制死菌DNA扩增，确定最佳的曝光时间为20 min。

图4 曝光时间对膜损伤菌的影响Figure 4 Effect of light exposure time on heat-treated bacteria

曝光时间是影响活菌检测的另一个重要因素，光照时间不充分，PMA不能完全被钝化，部分残留在菌悬液中，提取DNA时，活细胞的细胞膜被破坏，暴露出的DNA被PMA分子结合，使检测结果出现假阴性。卤钨灯的选择也会影响到曝光的时间，650 W卤钨灯虽然能降低耗时，但同时会产生大量的热量，有可能造成管口附近菌体的死亡。所以本研究选用500 W的卤钨灯距离20 cm，曝光20 min，一方面使与DNA结合的PMA与DNA分子进一步充分交联，同时使游离的PMA完全被钝化。

2.2.4 PMA对不同比例活菌和膜损伤菌影响 PMA对不同比例活菌和死菌的影响如表3所示，当样品全部为死菌时(活菌比例0%)，未加PMA处理的Ct值为16.21，加PMA处理后Ct值为23.28，差异极显著(P<0.01)，活菌的比例为25%，50%，75%，未加PMA处理的样品Ct值明显低于加入PMA样品的Ct值，说明PMA有抑制死菌DNA扩增的作用。当样品中活菌比例达到100%时，未加PMA样品的Ct值与加入PMA处理样品的Ct值无显著性差异(P>0.05)，说明加入的PMA对活菌的扩增几乎无影响。同时，活菌比例的增大导致Ct值相应的减少，说明经PMA处理后死菌DNA被PMA抑制不能扩增，可以消除死菌对PCR的扩增，降低假阳性结果出现的可能性。

表3 不同比例活菌样品PMA-qPCR结果†Table 3 PMA-qPCR Results of different live bacteria proportion

† △Ct=PMA处理组-对照组。

2.3 质粒标准品的制备及标准曲线的建立

质粒标准品初始拷贝数为6.39×108拷贝/μL。将其进行10倍梯度稀释，使浓度范围在1×101～1×108拷贝/μL。以拷贝数对数值和所得Ct值为横、纵坐标建立标准曲线，见图5。可以看出两者存在对应线性关系，r2=0.995 5，斜率为-3.220 4，该方法最低能够检出6.39×102拷贝/μL的溃疡菌。

2.4 PMA-qPCR的灵敏度

菌液10倍梯度稀释至101，102，103，104，105，106，107，经合适条件的PMA处理提取DNA，进行PMA-qPCR反应。根据标准曲线得到定量结果见表4，PMA-qPCR方法最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌见图6。

2.5 猕猴桃枝条样品活菌检测

染菌样品经PMA处理提取DNA，进行PMA-qPCR检测，根据标准曲线得到基因拷贝数，与平板计数的结果进行比较，显示两者无显著性差异(P>0.05)(表5)。

图5 Psa质粒标准曲线Figure 5 Plasmid standard curve

表4 不同稀释梯度菌液的PMA-qPCR结果†Table 4 PMA-qPCR results of different dilution bacteria

† UD表示未测得。

1～5分别为稀释至107，106，105，104，103的菌悬液扩增曲线，最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌

图6 PMA-qPCR灵敏度分析
Figure 6 PMA-qPCR sensitivity analysis

表5 染菌样品PMA-qPCR结果与平板计数结果比较†Table 5 Compare results of PMA-qPCR with plate count

† UD表示未测得。

3 结论

本试验以猕猴桃溃疡菌为研究对象，通过优化PMA处理条件，实现检测陕西猕猴桃溃疡病优势病原菌活菌的目的。结果表明，PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105 μg/mL，最佳暗孵育时间为8 min，最佳曝光时间为20 min，在此条件下，Psa死菌扩增被抑制，而活菌的扩增未受影响。同时，虽然优化后的PMA浓度对活菌的扩增未产生影响，但是该浓度相对此类文献而言还是偏高，所以对于陕西猕猴桃溃疡病优势病原菌是否对PMA具有更强的抵抗力，还需要进一步研究。