滕 钰， 徐 洪， 邹 莉， 李 琴， 罗 曼， 王 俊∗

（1. 贵州省食品药品检验所， 贵州 贵阳 550004； 2. 贵州圣济堂制药有限公司， 贵州 贵阳 551400）

重楼解毒酊属于独家批文品种， 是根据传承千年的苗族验方采用现代工艺研制而成， 主要成分有重楼、 艾叶、石菖蒲等， 具有清热解毒、 散瘀止痛功效[1］， 临床用于肝经火毒所致带状疱疹、 皮肤瘙痒、 虫咬皮炎、 流行性腮腺炎[2］， 收载于国家食品药品监督管理局国家中成药地方标准上升国家标准（皮肤科分册）。 微生物限度检查是药品质量控制非常重要的一部分[3］， 本研究结合供试品特性、给药途径及限度要求， 依据2015 年版 《中国药典》 四部[4］对重楼解毒酊进行了微生物限度检查方法适用性研究， 从而保障检验结果的准确性和有效性， 提高用药安全。

1 仪器与材料

1.1 样品 重楼解毒酊， 规格45 mL／瓶， 批号20170101、20170102、 20170103， 均由贵州圣济堂制药有限公司提供。

1.2 培养基及试剂 胰酪大豆胨液体培养基（TSB） （批号17032950）、 沙氏葡萄糖液体 培养基 （SDB） （批号150916）、 甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号1610083）、 胰酪大豆胨固体培养基（TSA） （批号1703254）、 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA） （批号17031651）、 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号1512232）， 均购于北京陆桥技术股份有限公司。 聚山梨酯80 （批号2014112601， 成都市科龙化工 试 剂 厂）； pH7.0 氯 化 钠-蛋 白 胨 缓 冲 液 （批 号3105593， 广东环凯微生物科技有限公司）。

1.3 菌种 白色念珠菌[CMCC （F） 98001］、 金黄色葡萄球菌[CMCC （B） 26003］、 枯草芽孢杆菌[CMCC （B）63501］、 铜绿假单胞菌 [CMCC （B） 10104］、 黑 曲霉[CMCC （F） 98003］ 均由中国食品药品检定研究院提供。

1.4 仪器 电子天平[型号PL602-L， 梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； 电热恒温水浴锅（型号DK-98-Ⅱ， 天津泰斯特仪器有限公司）； 低温培养箱、 恒温培养箱（型号BF240， 德国Binder 公司）； 生物安全柜 （型号BSC-1300ⅡA／B3， 新加坡艺思高科技有限公司）； 集菌仪（型号HTY-601， 浙江泰林生物技术股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 按2015 年版《中国药典》 四部要求制备[4］，并参考刘康连等[5］报道的方法。 用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假单胞菌、 白色念珠菌分别制成浓度不大于10 000、 1 000 cfu／mL 的菌悬液， 将黑曲霉分别制成浓度不大于10 000、 1 000 cfu／mL的孢子悬液， 备用。

2.2 供试品溶液制备 取本品10 mL， 加pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL[4］， 置40 ℃水浴中振摇混匀，即得（1 ∶10）。

2.3 回收比值 计数法适用性试验回收比值[6］= （试验组菌落数-供试品对照组菌落数） ／菌液组菌落数， 计算结果在0.5～2 范围内时， 表明方法可行[7］。

2.4 计数法适用性

2.4.1 试验组

2.4.1.1 平皿法 向7 份供试品溶液（每份10 mL） 中加入浓度不大于l0 000 cfu／mL 的“2.1” 项下菌液（需氧菌计数对应金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 铜绿假单胞菌、白色念珠菌、 黑曲霉， 霉菌和酵母菌计数对应白色念珠菌、黑曲霉） 各0.1 mL， 混匀， 使每1 mL 供试品溶液含菌量不大于100 cfu， 取1 mL 注入90 mm 无菌培养皿中， 倾注20 mL 45 ℃左右融化的培养基（需氧菌计数平皿加TSA，霉菌和酵母菌计数平皿加SDA）， 迅速混匀， 冷却凝固。

2.4.1.2 薄膜过滤法 向7 份供试品溶液（每份10 mL）中加入浓度不大于l 000 cfu／mL 的“2.4.1.1” 项下5 株菌液各0.1 mL， 混匀， 使每1 mL 供试品溶液含菌量不大于10 cfu， 全部过滤， 用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗10 次（每次100 mL）， 将滤膜面朝上贴于预制平板上（需氧菌计数对应TSA， 霉菌和酵母菌计数对应SDA）。 2种方法均每株菌平行制备2 个平皿， 按药典规定条件培养并计数。

2.4.2 菌液对照组 取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品溶液， 按“2.4.1” 项下方法操作[8］。

2.4.3 供试品对照组 取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代菌液， 按“2.4.1” 项下方法操作[8］。

2.4.4 阴性对照组 取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品溶液， 不加试验菌， 其他操作同“2.4.1” 项[6］。

2.4.5 不同计数法比较 采用平皿、 薄膜过滤法的回收比值（均取2 位有效数字）， 见表1。 5 种试验菌7 个试验组的回收比值均在0.5～2 范围内， 表明本品对金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、 白色念珠菌、 黑曲霉生长均有一定抑制作用； 其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强， 采用平皿法时， 其回收比值已接近范围下限0.5。 另外， 采用薄膜过滤法时5 株菌回收比值均有不同程度的提高， 表明该方法更能消除该品种的抑菌活性。

表1 不同计数法适用性试验结果

2.5 控制菌检查方法适用性

2.5.1 金黄色葡萄球菌

2.5.1.1 试验组 常规法为取供试品溶液10 mL， 接种至100 mL TSB 培养基， 加入金黄色葡萄球菌 （不大于100 cfu／mL） 混匀， 34 ℃下培养18 h， 取其培养物划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基， 34 ℃下培养18 h[4］， 观察结果； 稀释法为在200 mL TSB 培养基中加入10 mL 供试品溶液， 其他操作同常规法。

2.5.1.2 供试品对照组 不加试验菌， 增菌培养时间为24 h，选择、 分离培养时间为72 h[4］， 其他操作同“2.5.1.1” 项。

2.5.1.3 阴性对照组 取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试品， 其他操作同“2.5.1.2” 项。

2.5.2 铜绿假单胞菌

2.5.2.1 试验组 常规法为取供试品溶液10 mL， 接种至100 mL TSB 培养基， 加入铜绿假单胞菌（不大于100 cfu／mL）混匀， 34 ℃下培养18 h， 取其培养物划线接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基， 34 ℃培养18 h[4］， 观察结果； 稀释法为在200 mL TSB 培养基中加入10 mL 供试品溶液， 其他操作同常规法。

2.5.2.2 供试品对照组 不加试验菌， 增菌培养时间为24 h，选择、 分离培养时间为72 h[4］， 其他操作同“2.5.2.1” 项。

2.5.2.3 阴性对照组 取pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试品， 其他操作同“2.5.2.2” 项。

2.5.3 控制菌检查方法适用性 当TSB 体积为200 mL 时，试验组能检出相应阳性对照菌， 见表2， 表明用培养液稀释法（TSB 200 mL） 能消除该品种对金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌的抑菌作用。

表2 控制菌检查方法适用性试验结果

3 讨论

在对重楼解毒酊进行微生物检查方法适用性研究时主要存在2 个问题， 一方面由于该制剂中含有艾叶、 石菖蒲、重楼等多种抑菌成分[9-17］， 对药典要求的多株菌生长均有抑制， 采用常规平皿法进行微生物计数时， 回收比值偏低，抑菌活性消除不理想， 可能会导致假阴性结果出现， 不能真实反映制剂微生物污染状况； 另一方面虽然该品种对白色念珠菌和黑曲霉的抑制性不强， 但其为皮肤用药， 2015年版《中国药典》 对该类制剂微生物限度标准规定严格，尤其是霉菌和酵母菌总数为10 cfu／mL[4］， 故计数若采用平皿法或培养基稀释法， 会不利于企业内控标准制定和微生物安全质量控制。

2015 年版《中国药典》 中， 计数法部分消除样品抑菌性的主要技术手段为培养基稀释法、 薄膜过滤法、 添加中和剂[18］， 后者通常是与前两者联用。 薄膜过滤法直接过滤抑菌成分， 消除抑菌活性， 能有效避免假阴性结果出现，常用于检测中药液体制剂[19］， 此方法还有快速收集菌种、减少检测时间的优点[20］， 但不适用于非完全溶解的供试品[21］； 培养基稀释法虽对药品中抑菌成分进行稀释， 但没有完全消除， 在计数检测过程中抑菌成分仍可能对菌的生长不利， 进而对回收率和检出率造成影响[22］。 据报道[23］，高稀释级供试品会降低微生物检出， 同时增加试验步骤，延长试验时间， 增加污染风险， 对结果准确性的不利影响增多， 《中国药典》 对皮肤、 耳用、 口腔黏膜给药制剂的微生物计数限度要求比口服固体制剂高， 而上述制剂通常为液体制剂。 因此， 在限值要求较高， 样品药渣少、 溶解性好、 通过性佳的情况下， 薄膜过滤法是消除药品抑菌活性的合适方法。

2015 年版《中国药典》 将“方法验证” 改成了“方法适用性”， 更侧重于将试验条件、 供试品特性等因素作为一个整体系统来评价， 控制分析条件对诸因素的影响，使检测活动能达到预期目的[23-24］。 本研究以此为宗旨， 结合重楼解毒酊的抑菌成分、 理化特性和限度标准， 选择薄膜过滤法作为计数法， 既提高了回收比值， 又保证了霉菌和酵母计数法能贴合药典限度规定， 并选择培养基稀释法对该品种控制菌进行检查， 能在规定培养条件下检出阳性菌。