陈启洪， 段灿灿， 李晓飞， 张建永∗

（1. 遵义医学院药学院， 贵州 遵义 563009； 2. 遵义医学院基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室， 贵州 遵义 563009； 3. 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义 563009）

斑蝥为节肢动物门昆虫纲芫菁科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体， 始载于 《神农本草经》， 其性辛、热， 有大毒， 归肝、 胃、 肾经， 具破血逐瘀、 散结消癥等功效， 用于癥瘕、 顽癣等顽疾[1-2］。 现代研究表明，斑蝥主要成分为斑蝥素类， 具有抗肿瘤和抗病毒的作用， 此外还含有蛋白质、 氨基酸、 脂肪及脂肪酸、 核苷类、 微量元素等[3-5］。 目前， 斑蝥的质量控制及药理活性研究主要集中在斑蝥素上， 而对其中核苷类成分的报道较少， 其作为生物细胞维持生命活动的基本组成元素， 参与DNA 代谢过程， 具有抗肿瘤、 抗病毒、 基因治疗等多种生物活性， 所具有较强活性使其成为热点[6-9］。 贵州省作为斑蝥的重要产地， 具有丰富的资源，研究表明产于黔南布依族苗族自治州罗甸县的南方大斑蝥和黄黑小斑蝥体内的结合斑蝥素对人肝癌HepG2 细胞增殖抑制作用明显优于其他地区同种斑蝥， 是贵州优良地域种[10-11］。 因此， 本研究采用HPLC 法对斑蝥中核苷类成分进行检测， 同时测定贵州省罗甸县不同乡镇及来源斑蝥中该成分， 以期为该昆虫多指标质量控制及核苷类成分合理开发应用提供依据。

1 材料

EClassical 3100 高效液相色谱仪（自动进样器、 柱恒温箱、 可变波长检测器） （大连依利特公司）； BT125D 型电子天平（十万分之一， 德国赛多利斯公司）； Aquelix 超纯水处理器（美国Millipore 公司）； RE-2000A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； BCD-579WE 冰箱（青岛海尔股份有限公司）； SG3300HE 超声仪（上海冠特超声仪器有限公司）。 尿 嘧 啶 （AB0542， 含 有 量＞98%）、 次 黄 嘌 呤（AB0366， 含有量＞98%） 对照品均购自成都埃法生物科技有限公司； 尿嘧啶核苷（PS16091802， 含有量＞98%） 对照品购自成都普斯生物科技有限公司。 甲醇、 冰醋酸为色谱纯； 无水乙醇为分析纯。

斑蝥均采自贵州， 经遵义医学院李晓飞教授鉴定为芫菁科昆虫南方大斑蝥（大斑芫菁， Mylabris phalerata Pallas）或黄黑小斑蝥（小斑芫菁， Mylabris cichorii Linnaeus） 的干燥体。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[12］Phenimenex Synergl 4 μm Polar-RP80A柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相1%冰醋酸（A） -甲醇（B）， 梯度洗脱， 程序见表1； 体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃； 检测波长254 nm； 检测时间30 min； 进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤各约5.0 mg， 精密称定， 置于10 mL 量瓶中， 加纯水溶解并定容， 即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称定昆虫粉末约2.5 g， 加50 mL 75%乙醇回流提取2 次， 每次1.5 h， 合并2 次滤液，水浴挥干乙醇， 冷却， 加水补足到100 mL， 放置水沉24 h， 抽滤除沉淀， 将样品溶液减压浓缩冷却后加水定容至25 mL量瓶中， 摇匀， 过0.22 μm 微孔滤膜， 即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取纯水， 尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤对照品溶液， 供试品溶液适量， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。 结果， 在与尿嘧啶、 尿苷、 次黄嘌呤对照品色谱图相应的保留时间处， 供试品溶液色谱图中有三者吸收峰， 空白溶剂色谱图中未显示对应的色谱峰， 表明空白溶剂无干扰， 各峰分离度＞1.5， 色谱图见图1。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液560、 480、 400、 320、 240、 160、 80、 4 μL 于2 mL 量瓶中， 加纯水补足2 mL 稀释至140、 120、 100、 80、 60、 40、20、 1 μg／mL， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。 以溶液质量浓度为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，见表2， 可知尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验 取同一对照品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次， 测得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤峰面积RSD 分别为0.13%、 0.56%、 0.38%， 表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一斑蝥（八总乡黄黑小斑蝥） 6份， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤含有量RSD 分别为3.04%、 2.97%、 2.80%， 表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（八总乡黄黑小斑蝥）， 于室温放置0、 2、 4、 8、 12、 24 h 后在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤峰面积RSD 分别为0.52%、 0.79%、 0.38%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取同一核苷类成分含有量已知的斑蝥（八总乡黄黑小斑蝥） 1.25 g， 精密加入对照品溶液，使其加入量分别相当于各对照品含有量的50%、 100%、150%， 按“2.2.2” 项下方法制备3 份供试品溶液（共9份）， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算回收率， 结果见表3。

图1 各成分HPLC 色谱图

表3 各成分加样回收率试验结果（n=9）

2.4 样品含有量测定 取罗甸不同乡镇和来源斑蝥， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g）

3 讨论

3.1 核苷类组分确认 目前斑蝥含有量测定主要集中在其脂溶性成分上， 如2015 版《中国药典》 一部选择斑蝥素，此外有学者建立了斑蝥脂肪油中棕榈酸、 棕榈油酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸、 亚麻酸、 花生酸共7 种脂肪酸含有量的测定方法[13］， 可用于其脂溶性部位的质量控制。 在水溶性成分上， 有学者采用毛细管气相色谱法建立了斑蝥中天冬氨酸、 谷氨酸、 丝氨酸、 组氨酸、 甘氨酸、 苏氨酸、 脯氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 蛋氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 精氨酸、 苯丙氨酸、 赖氨酸等15 种氨基酸含有量的测定方法[14］， 并用于斑蝥的炮制研究； 有学者采用原子吸收光谱法建立了斑蝥药材中铁、 锰、 铜、 锌、 砷等微量元素的含有量测定方法等用于质量控制[15］； 然而关于核苷类成分的质量分析报道较少， 目前仅有一篇报道了斑蝥指纹图谱，并发现了尿嘧啶核苷[16］。 为此， 本研究首先通过HPLC 分析， 探索腺嘌呤、 腺嘌呤核苷、 2′-脱氧腺苷、 双脱氧腺苷、 鸟嘌呤、 鸟嘌呤核苷、 脱氧鸟苷、 黄嘌呤、 次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、 胞嘧啶、 胞嘧啶核苷、 胸腺嘧啶、 胸腺嘧啶核苷、 尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 2′-脱氧尿苷、 虫草素18 种中药中常见的核苷类成分[7-9，17-19］在斑蝥中是否存在， 最终确认尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤。

3.2 样品处理及色谱条件筛选 在供试品溶液制备方法研究中， 本实验考察了超声、 回流提取， 发现回流提取能得到更多核苷类成分。 然后， 考察了不同酸（磷酸、 甲酸、冰醋酸） 及其比例（0.5%、 1%、 2%） 对色谱峰分离的影响， 结果显示1%冰醋酸具有较好的分离效果。

3.3 含有量测定 本实验结果表明， 罗甸不同乡镇之间斑蝥各成分含有量差异较大， 表明即使是近产区质量也可能存在差异； 但同一乡镇的南方大斑蝥和黄黑小斑蝥之间差异较小， 提示产地对其质量影响可能较大。 在所测定的各核苷类成分中， 尿嘧啶含有量为0.16 ～0.71 mg／g， 尿嘧啶核苷含有量为0.71～1.21 mg／g， 次黄嘌呤含有量为0.47～1.07 mg／g， 其中尿嘧啶以沫阳镇黄黑小斑蝥最高， 尿嘧啶核苷以八总乡黄黑小斑蝥最高， 次黄嘌呤以红水河镇黄黑小斑蝥最高， 尿嘧啶差异最高可达4 倍。 在3 种核苷类成分总含有量方面， 红水河镇黄黑小斑蝥为2.44 mg／g， 整体优于其他乡镇和来源的样品， 并接近药典规定的斑蝥素（3.5 mg／g）[20］， 可能与后者抗肿瘤、 抗病毒功效有协同作用， 因此对其质量控制是有必要的。

综上所述， 本实验建立的HPLC 法能用于分析3 种核苷类成分， 其准确性、 重复性和稳定性良好， 适用于斑蝥中尿嘧啶、 尿嘧啶核苷、 次黄嘌呤含有量的测定， 对相关研究及多指标成分质量控制具有重要意义。