陈文露， 彭新宇， 余静贤， 高 彪， 徐志宏， 潘育方

（1. 广东药科大学， 广东 广州 440100； 2. 广东省农业科学院动物卫生研究所， 广东 广州 440100；3. 广东省中兽药工程技术研究中心， 广东 广州 440100； 4. 华南农业大学， 广东 广州 440100）

柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根， 按性状不同， 分别习称为“北柴胡” 和“南柴胡”[1］， 具有疏散退热、 疏肝解郁、 升举阳气等功效， 多用于感冒发热、 寒热往来、 胸胁胀痛、 月经不调、 子宫脱垂、 脱肛[1］等。 柴胡注射液收录在《中药成方制剂》 第十七册中， 是我国第一个研制的中药注射液[2］， 具有清热解表的功效， 临床上常用于治疗感冒和流行性感冒或疟疾引起的发热， 疗效确切，而近年来学者还发现它有抗病毒、 抗肿瘤、 抗炎、 增强学习记忆力、 提高免疫力的作用[3-5］。

随着柴胡注射液临床应用趋于广泛， 其不良反应报道也逐渐增多， 相关的副作用有荨麻疹、 皮疹、 瘙痒、 恶心呕吐、 腹胀腹泻、 头晕头痛、 视力模糊、 胸闷烦躁、 血压异常、 肺水肿等， 严重的甚至会引起呼吸困难、 肾功能衰竭、 血压骤降、 意识丧失等， 据分析有可能是提取工艺中产生了引起副作用的物质[6-9］。 柴胡注射液由柴胡精油进一步制备而得， 提取工艺有水蒸法、 酸浸法、 盐析法、 酸浸盐析法等[10-12］， 但目前还没有对不同制备工艺注射液进行成分分析的报道。 本实验拟通过紫外分光光度法和GC-MS法对市售、 不同工艺制备的柴胡注射液进行吸光度比较和成分鉴定， 以期为进一步提高柴胡注射液的质量、 减少毒副作用提供依据。

1 材料

Agilent GC-MDS 7890B-5977A、 HP-5MS 弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm， 5 μm） （美国安捷伦公司）； PHS-3C 数显PH 计（上海精密科学仪器有限公司）； UV-3100PC紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）； EXD-322B 电子天平（福建衡科仪器有限公司）。 柴胡注射液（批号16020302A， 河南省康华药业有限公司）。 盐酸（批号20111103， 广州化学试剂厂）； 氯化钠（批号20170206，广州化学试剂厂）； 1， 2-丙二醇（批号20170815， 上海凌峰化学试剂有限公司）； 吐温-80 （批号20170311， 天津市科密欧化学试剂有限公司）； 柠檬酸三钠（批号20170929，国药集团化学试剂有限公司）。 柴胡（康美药业股份有限公司， 批号20161012）， 经广东药科大学中药学院程轩轩副教授鉴定为北柴胡。

2 方法

2.1 供试品制备

2.1.1 柴胡精油提取

2.1.1.1 水提法 柴胡50 g 切段， 段长1 ～2 cm， 加入550 mL注射用水， 70 ℃下浸泡8 h （过夜） 后蒸馏提取，初馏液收取150 mL， 再进行重蒸馏， 重馏液收50 mL。

2.1.1.2 盐析法 柴胡50 g 切段， 段长1 ～2 cm， 加入550 mL注射用水， 70 ℃下浸泡8 h （过夜） 后按占溶液25%比例， 加入氯化钠137.5 g， 蒸馏提取， 初馏液收取150 mL， 再进行重蒸馏， 重馏液收50 mL。

2.1.1.3 酸浸法 柴胡50 g 切段， 段长1 ～2 cm， 加入550 mL稀盐酸溶液（pH=1.0）， 70 ℃下浸泡8 h （过夜）后蒸馏提取， 初馏液收取150 mL， 再进行重蒸馏， 重馏液收50 mL。

2.1.1.4 酸浸盐析法 柴胡50 g 切段， 段长1～2 cm， 加入550 mL 稀盐酸溶液（pH=1.0）， 70 ℃下浸泡8 h （过夜） 后按溶液25%比例加入氯化钠137.5 g 蒸馏提取， 初馏液收取150 mL， 再进行重蒸馏， 重馏液收50 mL。

2.1.2 柴胡注射液配制 精密量取“2.1.1” 项下4 种重馏液各40 mL， 加入0.15 g 吐温-80、 1 g 1， 2-丙二醇， 搅拌使油完全溶解， 再加入氯化钠0.45 g， 溶解后， 调pH 值至6.6， 加注射用水至50 mL， 0.22 μm 微孔滤膜过滤， 灌封， 115 ℃灭菌30 min， 即得。

2.2 紫外分光光度计测定吸光度

2.2.1 最大吸收波长测定 市售柴胡注射液用纯化水稀释10 倍[13］， 测定的紫外光谱和最大吸收波长， 见图1。 由图可知， 市售柴胡注射液在275 nm 波长处有最大吸收峰， 故在此处进行吸光度检测。

图1 柴胡注射液的紫外光谱图

2.3 GC-MS 分析 取市售柴胡注射液和“2.1.1” 项下4种工艺制备的柴胡注射液各10 mL， 分别密封于50 mL 顶空进样瓶， 水浴80 ℃， 平衡10 min， 取顶空气体1 mL 上机检测， 40 ℃柱温保持5 min， 以5 ℃／min 升至50 ℃， 然后以20 ℃／min升至250 ℃， 保持5 min； EI 离子源； 电子能量70 eV； 离子温度230 ℃； 接口温度250 ℃； 载气为高纯氦气； 分流模式不分流； 体积流量1.0 mL／min； 进样器为手动进样； 进样口温度250 ℃； 传输线温度250 ℃； 溶剂延迟3 min； 采集质量范围m／z 30～350； 工作站为MASS HUNTER。

3 结果

3.1 吸光度 市售、 水蒸馏法制备、 盐析法制备、 酸浸法制备、 酸浸盐析法制备柴胡注射液吸光度分别为0.449 0、0.651 7、 0.5963、 1.1758、 0.824 4， 可知吸光度最低的为市售， 其次为盐析法、 水蒸法、 酸浸盐析法制备， 最高的为酸浸法制备。

3.2 色谱图 图2 ～6 显示， 市售不同工艺制备的样品色谱图有明显差异， 出峰时间和成分数量明显不同。 市售、水蒸馏法制备、 盐析法制备、 酸浸法制备、 酸浸盐析法制备的色谱峰总面积分别为100 218 400、 106 965 460、54 324 058、 58 264 089、 38 013 458， 差异很大， 最高的为水蒸法制备， 最低的为酸浸盐析法制备。

3.3 成分鉴定 根据MST14 谱库检索定性分析各组分，采用色谱峰面积归一法进行相对定量。 表1 显示， 5 种柴胡注射液中一共鉴定出140 种成分， 其中1 号样品25 种，2 号样品33 种， 3 号样品52 种， 4 号样品60 种， 5 号样品23 种， 正己醛、 庚醛、 苯甲醛、 壬醛、 正辛醛为这5 种样品的共有成分。

图2 市售样品GC-MS 色谱图

图3 水蒸法样品GC-MS 色谱图

图4 盐析法样品GC-MS 色谱图

图5 酸浸法样品GC-MS 色谱图

图6 酸浸盐析法样品GC-MS 色谱图

表1 不同样品中成分鉴定结果

续表1

续表1

4 讨论

根据《中药成方制剂》 第十七册， 柴胡注射液稀释10倍后在278 nm 波长处的吸光度不小于0.65， 但只有水蒸法、 酸浸法和酸浸盐析法提取的样品达到了标准。 糠醛和5-甲基呋喃醛不仅是柴胡注射液的有害物质， 也是引起不良反应的主要成分； 糠醛是柴胡在酸盐条件下柴胡纤维的水解产物， 5-甲基呋喃醛是柴胡皂苷中糖的水解产物[14］；注射液在275 nm 处的吸光度主要是糠醛的贡献[15］， 故仅以吸光度来衡量柴胡注射液是否达标有失偏颇， 缺乏专属性， 也无法确定糠醛存在与否， 现行标准也已经取消了关于吸光度的限定。

有报道称， 正己醛、 正庚醛、 桉叶油醇、 桃金娘烯醇、匙桉醇、 桉叶素等具有解热、 抗炎、 抗菌、 治疗支气管炎、急慢性鼻窦炎、 平喘、 祛痰的药效学作用[16-21］。 GC-MS 结果表明， 5 种样品一共鉴定出140 种成分， 其中正己醛、庚醛、 正辛醛、 苯甲醛、 壬醛为5 种样品的共有成分， 它们与样品药效学的相关性值得进一步研究。

市售样品发现25 种成分， 有效成分正己醛28.38%、庚醛15.61%， 共占比约43.99%； 有害成分糠醛4.19%；其他主要成分有反式-2-壬烯醛3.18%、 5-ethylcyclopent-1-enecarboxaldehyde 5.50%、 壬 醛5.00%、 2， 5-二 氢 甲 苯5.51%、 2-methylene cycloheptanol， 4.96%、 正辛醛4.69%。

水蒸法提取样品发现33 种成分， 有效成分正己醛2.44%、 庚醛6.93%、 桃金娘烯醇1.72%、 匙桉醇2.48%，共占比约13.57%； 其他主要成分有顺-Z-α-环氧化红没药烯5.03%、 2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪4.97%、 4-乙酰基-1-甲基-环 己 烯7.60%、 壬 醛5.63%、 2-羟 基-3， 5-辛 二 烯4.05%、 2， 3-辛二酮6.45%、 苯甲醛4.64%。

盐析法提取样品发现52 种成分， 有效成分正己醛4.75%、 庚醛5.92%、 桉叶油醇1.75%、 匙桉醇1.61%，共占比约14.03%； 有害成分糠醛3.08%； 其他主要成分有2， 5， 5-trimethyl-1， 3， 6-heptatriene 3.19%、 4-乙 酰 基-1-甲基-环己烯4.19%、 2-methyl-3-methylene-1-cyclopentanecarboxylic acid methyl ester 5.68%、 acetic acid、 1， 7， 7-trimethyl-bicyclo [2.2.1］ hept-2-yl ester 3.83%。

酸浸法提取样品发现60 种成分， 有效成分正己醛2.32%、 庚 醛 0.77%、 1、 4-桉 叶 素 1.02%、 匙 桉 醇0.70%、 桉叶油醇3.53%， 共占比约8.34%； 有害成分糠醛19.33%、 5-甲基呋喃醛[16］2.62%， 共占比约21.95%；其他主要成分有bisabolol oxide B 3.76%、 合成右旋龙脑4.73%、 反式-2-壬烯醛4.29%、 4-乙酰基-1-甲基-环己烯4.91%、 1， 5-dimethyl-6-methylenespiro [2.4 ］ heptanes 4.45%、 2-糠酸甲酯5.62%。

酸浸盐析法提取样品发现23 种成分， 有效成分正己醛17.15%、 庚 醛5.56%、 1、 4-桉 叶 素2.59%， 共 占 比 约25.30%； 有害成分糠醛3.87%、 3-糠醛4.72%， 共占比约8.59%； 其他主要成分有（＋） -莰醇6.65%、 反式月桂烯醛8.32%、 对乙氧基苯胺3.74%、 4-乙酰基-1-甲基-环己烯6.77%、 3-甲基四氢苯酐10.19%、 4-乙烯基环己酮5.33%、2-糠酸甲酯5.75%。

根据现行标准[22］， 柴胡注射液应是用水蒸法浸泡蒸馏所得， 气相色谱检测每1 mL 样品含糠醛不得超过60 μg。但结果显示， 水蒸法提取的样品是唯一不含糠醛、 3-糠醛、5-甲基呋喃醛这3 种有害成分的， 表明制备工艺对产品成分有决定性作用， 而酸浸法和酸浸盐析法提取制备的样品有害成分占比是最高的， 因此不建议使用这2 种生产工艺制备。 随着柴胡注射液在临床上的广泛应用， 为确保临床用药安全， 有必要对糠醛含有量进行更严格的限制。

现行标准中只有正己醛的特征图谱， 没有相应的含有量规定， 所以课题组认为标准不够完善， 一是目前还没有正己醛和柴胡注射液药效相关的直接证据； 二是柴胡注射液相关文献报道的可能有效成分除了正己醛外， 还有正庚醛、 桉叶油醇、 桃金娘烯醇、 匙桉醇、 桉叶素等； 三是若只对正己醛做特征图谱， 而没有最低含有量限制， 难免有不法厂家为了达到标准而对柴胡蒸馏液进行稀释， 进而既可降低糠醛含有量， 又可增加产量， 影响药效。 因而， 需对柴胡注射液进行药效学实验， 验证其作用物质基础和机制， 确定有效物质的种类及其含有量， 进一步完善该制剂质量标准。