幺宝金， 果淑凤， 袁劲松， 刘 佳， 赵大庆∗

（1. 长春中医药大学， 吉林省人参科学研究院， 吉林 长春 130117； 2. 北京世纪圣科科技发展有限公司，北京 100010； 3. 长春中医药大学药学院， 吉林 长春 130117）

圣科健骨胶囊是由中国预防医学科学院和中国疾病预防控制中心专家结合国际上防治骨质疏松症的最新科研成果研制而成的保健产品， 作为健骨类产品在市场上销售多年， 取得了良好疗效， 该制剂从骨代谢本质入手， 遵循“补骨、 修骨和养骨”三位一体理论， 将国际公认的高效健骨因子与纳米钙、 活化维生素D3、 微量元素等多种骨营养素按照一定比例复合而成， 通过调节内分泌可有效促进骨基质生成， 达到补充骨量、 修复损伤骨组织、 养护骨骼的功效。 本实验采用同位素标记蛋白质定性定量（iTRAQ） 分析技术结合生物信息学分析方法， 对圣科健骨胶囊给药后大鼠血清蛋白组进行差异表达分析， 以期揭示其健骨功效的内在分子机制。

1 材料

清洁级雌性SD 大鼠40 只， 体质量（220±20） g，购于长春市亿斯实验动物技术有限公司， 实验动物生产许可证号SCXK （吉） -2016-0003。 圣科健骨胶囊由北京世纪圣科科技发展有限公司提供， 主要由高效健骨因子与纳米钙、 活化维生素D3、 微量元素等多种骨营养素按照一定比例复合而成。 ProteoMiner 低丰度蛋白富集试剂盒购于美国Bio-Rad公司； iTRAQ 蛋白标记试剂盒购于美国AB Sciex公司。 二硫苏糖醇、 碘乙酰胺、 三乙基碳酸氢铵、胰蛋白酶等为分析纯， 购于美国Sigma 公司。 乙腈、 甲醇为色谱纯， 购于美国Thermo 公司； 其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 蛋白提取制备

2.1.1 给药及血清采集 将大鼠随机分为空白组和给药组， 每组20 只， 给药组给予1 g／kg 圣科健骨胶囊生理盐水混悬液， 空白组给予等体积生理盐水， 每天灌胃给药1 次， 连续3 周。 末次灌胃给药次日， 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉， 颈总动脉收集血液， 4 ℃静置2 h， 2 000×g 离心5 min， 收集上清液， 10 000×g 离心10 min， 收集血清， 血清组分保存于-80 ℃下。

2.1.2 蛋白富集及酶解 将空白组、 给药组血清分别合并， 经ProteoMiner 低丰度蛋白富集试剂盒去除免疫球蛋白和白蛋白等高丰度蛋白， 采用Bradford 法测定蛋白浓度。 取2 组血清蛋白各100 μg， 加入10 mmol／L 二硫苏糖醇， 37 ℃下还原处理1 h 后加入20 mmol／L 碘乙酰胺烷化处理45 min， 再加入5 μg 胰蛋白酶， 37 ℃下酶解4 h后再补加5 μg 继续酶解8 h， 冻干。

2.1.3 蛋白酶解、 标记和纯化 将酶解蛋白冻干粉溶于0.5 mol／L 三乙基碳酸氢铵中， iTRAQ 蛋白标记试剂盒进行酶解蛋白标记， 岛津LC-20AB 液相系统进行肽段分离。 分析采用Ultremex SCX 层析柱（美国Phenomenex 公司）； 洗脱液Buffer A，pH 2.7， 含25 mmol／L 磷酸二氢钾和25% 乙腈；Buffer B， pH 2.7， 含25 mmol／L 磷 酸 二 氢 钾、1 mol／L氯化钾和25% 乙腈， 洗脱条件为Buffer A 10 min， 5% ～35% Buffer B 11 min， 35% ～80%Buffer B 1 min； 吸收波长214 nm。 收集不同组分，经Strata X 层析柱除盐后冻干。

2.1.4 液质鉴定及生物信息学分析 通过超高液相色谱nanoACQUITY 联合质谱TripleTOF 5600 技术进行肽段鉴定， 采用Symmetry C18、 BEH130 C18色谱柱（美国Waters 公司）； 流动相A 液为水-乙腈-甲酸 （98 ∶ 2 ∶ 0.1）， B 液 为 水-乙 腈-甲 酸（2 ∶98 ∶0.1）； 洗脱条件为A 液15 min， 5%B 液1 min， 5% ～35% B 液40 min， 35% ～80% B 液5 min， 80%B 液5 min； 质谱参数反射扫描， 分辨率3.0×104以上； 脉冲频率11 kHz； 碰撞能量（35±5 eV）。 然后， 通过ProteinPilot 5.0 软件（美国AB Sciex 公司） 进行数据分析， 蛋白鉴定错误率FDR≤1%， 当2 组样品蛋白质丰度差异倍数≥1.5 倍或≤0.67 倍， 且P＜0.05 时可认定为差异蛋白， 其功能富集采用AmiGO 进行分析。

3 结果

3.1 血清差异蛋白功能富集分析 共鉴定出237 种表达蛋白， 与空白组比较， 给药组显著上调的差异蛋白（差异倍数≥1.5 倍， P＜0.05） 有130 种， 显著下调的（差异倍数≤0.67 倍， P ＜0.05） 有107种。 针对这些差异蛋白， 首先进行功能富集分析，包括细胞组分、 分子功能、 生物进程3 种功能分类。

在细胞组分功能分类中， 差异蛋白主要归类为细胞外区域、 皮质肌动蛋白细胞骨架、 蛋白酶体核心复合物、 肌动蛋白丝、 肌动球蛋白等， 具体见表1。

表1 血清差异蛋白细胞组分富集分析（P＜0.05）Tab.1 Cellular component enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

在分子功能分类中， 差异蛋白主要归类为肽酶调节剂活性、 抗原结合、 肽酶抑制剂活性、 酶抑制剂活性、 过氧化物酶活性、 丝氨酸型肽链内切酶抑制剂活性等， 具体见表2。

在生物进程分类中， 差异蛋白主要归类为蛋白水解调节、 外源刺激反应调节、 压力反应调节、 大分子复合物亚基组织、 肽链内切酶活性调节、 肽酶活性调节等， 具体见表3。

3.2 含药血清健骨功效分子机制研究 基于“3.1” 项下结果， 对给药后大鼠血清中显著上调（差异倍数≥1.5 倍， P＜0.05） 的差异蛋白作进一步分析， 结果共筛选出14 种调控骨形成及骨质密度的功能蛋白， 具体见表4， 主要包括Greb1 蛋白（Greb1）、 丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶D3 （Prkd3）、张力蛋白 （Tns4）、 丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M（Serpina3m）、 微管相关蛋白1 A （Map1a） 等。

表2 血清差异蛋白分子功能富集分析（P＜0.05）Tab.2 Molecular function enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

3.3 含药血清抗炎功效分子机制研究 基于“3.1” 项下结果， 对给药后大鼠血清中显著下调（差异倍数≤0.67 倍， P＜0.05） 的差异蛋白作进一步分析， 结果共筛选出12 种参与炎性反应的功能蛋白， 具体见表5， 主要包括锌指同源蛋白2（Zfhx2）、 NF-kappa-B 抑制剂zeta （Nfkbiz）、 激肽原-1 （Kng1）、 丝氨酸蛋白酶hepsin （Hpn） 等。

4 讨论

本实验采用iTRAQ 分析技术结合生物信息学分析方法， 对圣科健骨胶囊给药后大鼠血清蛋白组进行系统分析， 共鉴定出237 种差异蛋白。 功能富集分析结果表明， 这些差异蛋白主要为细胞外基质、 细胞骨架蛋白、 蛋白酶体复合物等， 主要参与酶调节、 抗原结合、 蛋白水解调节、 外源刺激反应调节、 压力反应调节、 大分子复合物亚基组织、 肽酶活性调节等生物进程。

表3 血清差异蛋白生物进程富集分析（P＜0.05）Tab.3 Biological process enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

表4 含药血清健骨功效差异蛋白分析Tab.4 Differential protein analysis of medicated serum for bone-invigorating effect

表5 含药血清抗炎功效差异蛋白分析Tab.5 Differential protein analysis of medicated serum for anti-inflammatory effect

与空白组比较， 圣科健骨胶囊组显著上调的差异蛋白主要包括Greb1、 Prkd3、 Tns4、 Serpina3m等调控骨形成及骨质密度的功能蛋白。 其中，Greb1 作为雌激素调节通路的重要分子， 在成骨细胞和成软骨细胞中表达量显著上调， 其遗传变异与骨密度变化导致的骨质疏松密切相关[1-2］； Prkd3属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族成员， 是成骨细胞分化和矿化结节形成的重要调控因子[3］； Tns4属于支架蛋白家族成员， 是细胞生长和迁移的重要调控因子， 主要通过触发整联蛋白与肌动蛋白细胞骨 架 的 解 偶 联 来 实 现[4］； Serpina3m、 Serpina3l、Serpina3k 同属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpina3 亚型， 可通过抑制局部丝氨酸蛋白酶浓度进而调控骨髓造血微环境的动态平衡[5］； Map1a 属于微管相关蛋白家族成员， 可通过调节微管组装、 微管结构及功能促进成骨细胞增殖和分化[6］； Prdx2 主要在骨髓基质细胞中表达， 可有效阻止骨髓老化[7］； Prl是一种蛋白质激素， 可减少破骨细胞形成和骨质流失， 促进骨形成[8］； Gpx1 是一种抗氧化酶， 主要调控细胞防御氧化损伤， 从而防止骨质疏松症等与年龄相关疾病的发生[9］； Epb41 最初被认为是红细胞膜分子， 主要负责维护细胞的完整性及膜骨架和跨膜蛋白之间的相互作用， 最近研究表明， 该基因缺失小鼠肠钙吸收功能受损， 进而导致继发性甲状旁腺功能亢进所致的骨钙缺失[10］； 另外， 显著上调的差异表达蛋白还包括具有抗炎、 抗感染、 排毒功效的功能蛋白， 如Ngp、 Cfp、 Ces1c 等[11-13］。 由此表明， 圣科健骨胶囊的健骨功效主要是通过上调以上参与调控骨密度和骨形成过程的功能蛋白来实现的。

与空白组比较， 圣科健骨胶囊组显著下调的差异 蛋 白 主 要 包 括 Zfhx2、 Nfkbiz、 Kng1、 Hpn、Prkcsh 等参与骨关节炎和风湿性关节炎炎性反应的相关因子。 其中， Kng1 是一种高分子量激肽原，该基因缺失小鼠可有效拮抗PG-PS 所致骨关节炎炎性反应及软骨损伤[14］； Hpn 是一种丝氨酸蛋白酶， 大量研究表明蛋白水解级联中的丝氨酸蛋白酶导致细胞外基质如骨关节炎软骨组织的病理性损伤[15］； Pcsk9 是一种促炎因子， 其基因缺失小鼠可有效降低炎性反应相关因子表达[16］； Cd5l、 Fcn2、Xpnpep2、 Ganab 等在骨关节炎和风湿性关节炎患者关节液或关节软骨中表达量显著上调[17-20］；DKK3 缺失可抑制NF-κB 信号通路， 进而降低炎性反应症状[21］； Nfkbiz 为非典型IκB 蛋白家族成员，也为各种炎症刺激诱导下NF-κB 的主要反应因子，既是促炎因子， 又是抗炎基因产物活性的调控因子[22］； Zfhx2、 Prkcsh、 Napsa 等在炎性反应调控中发挥重要作用[23］。 由此表明， 圣科健骨胶囊可通过抑制相关炎性因子表达来对骨关节炎和风湿性关节炎实现防治作用。