李 超 张培育 徐 军 张 敏

(1. 华中农业大学水产学院, 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 池塘健康养殖湖北省工程实验室, 武汉 430070;2. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072)

数百年来, 植物学家们收集并保存了大量的包含采集日期、地理信息、生境、形态学和物候学特征等信息在内的植物标本[1], 借助历史采集标本可以分析长期的环境污染和全球变化对植物的影响[2—3]。通过不同年份植物标本花期的对比发现全球变暖将导致植物的花期提前和持续时间的缩短[4—7]。同时, 研究发现植物的春季开花和出芽时间与冬春季的温度呈负相关关系[8—10]。目前, 相关研究主要通过观察植物标本的外部形态和物候特征(如株高、叶面积、首次开花时间、花期高峰、落叶和结果时间等)来探究其在长期的环境因素影响下的响应机制[11—14], 因此不能综合反映植物体应对自然环境变化的响应机制。

通过对长期生态调查研究过程中保存下来的植物标本的碳、氧稳定同位素分析可以揭示全球大气CO2浓度升高, 以及植物对水分利用情况的变迁[15—18]。植物标本叶片组织中氮稳定同位素含量的下降主要是由在人类影响下全球氮循环受阻, 生态系统中氮元素的沉降增加导致的[19]。水生植物氮稳定同位素, 由于其容易受环境中氮升高而富集,可以用来回溯人类活动造成的水体富营养化发展进程[20—23]。

水生沉水植物作为淡水生态系统中水生植被的重要组成部分之一, 通过对大量水生生物标本稳定同位素的研究分析我们可以了解某一历史时期水体环境的变化, 并探究沉水植物对不同环境因子改变的响应机制, 是研究水生态系统历史变迁过程的重要工具。但是, 相对于长期大量的生态调查留下的数目惊人的水生植物标本来说, 相关的稳定同位素研究仍鲜有报道。这可能与植物标本的稳定同位素值易受制作和保存过程的影响而发生变化有关。目前的大量研究都关注于水生动物(尤其是鱼类等)制作标本的过程和保存中对其稳定性同位素的影响。研究发现福尔马林溶液浸泡保存的浮游动物样品中δ13C和δ15N的值都显著上升[24], 但是也有研究认为福尔马林溶液处理的标本中δ13C值呈现下降的趋势[25]。相关的研究也曾在鱼类组织标本中展开[26—28]。但是, 水生沉水植物蜡质标本的制作和保存过程对其稳定同位素值的影响, 还没有相关的研究报道。

本实验选取了金鱼藻(Ceratophyllum demersum)、穗状狐尾藻(Myriophyllum spicatum)、马来眼子菜(Potamogeton malaianus)3种沉水植物, 按照传统野外的方法制作和保存蜡质标本。通过对沉水植物标本制作和保存阶段碳、氮稳定同位素值的测定分析, 为后续利用水生植物标本碳、氮稳定同位素值来研究水生态系统变化的可靠性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2011年11月采集金鱼藻、穗状狐尾藻和马来眼子菜3种沉水植物, 共计100份植物样品。其中金鱼藻采自武汉东湖(N 30.5567°, E 114.3866°), 穗状狐尾藻和马来眼子菜采自中国科学院武汉植物园(N 30.5410°, E 114.4196°)。所有样品均选取地上部分或整株植株, 后经自来水冲洗干净, 并小心去除附着藻类。

1.2 蜡质标本制作

为了与以前的传统野外采集制作标本的方法一致, 我们参照了传统的制作方法[29,30]。待植物清洗干净后, 我们使用干净的未被用作它途的报纸,将植物标本夹在报纸中, 每份标本放置一个标签,记录好采样时间, 采样地点, 物种名和分组代码。每种植物, 按照采样的地点, 分成3—5份。标本用木夹子固定, 放置于阴凉通风处, 前1周每天更换1次报纸, 之后每2天更换1次报纸, 直至标本干燥。然后将标本在饱和的升汞溶液(HgCl2)中浸泡5min,用以杀死标本上的细菌及虫卵等微生物, 最后将标本保存在标本柜中。

1.3 同位素样品采集

选取植物叶片组织用于同位素的测定。在制作标本之前, 我们从每种植物样品中随机抽取一株,在烘箱中用60℃烘干大于48h至恒重。第一次的鲜样采集作为对照(Control)。之后再采集1次所有植物干燥后的样本(Dry)。浸泡过后的样品采集1次(AS), 然后分别再在保存1周后(1 W)、1个月后(1 M)、2个月后(2 M)、3个月后(3 M)、4个月后(4 M)、5个月后(5 M)和6个月后(6 M)采集一次样。

1.4 同位素测定

在样品采集后, 60℃烘干大于6h至恒重。干燥后的样品用振荡碾磨仪碾磨至粉末状供后续测样。大约3 mg干重的样品, 被用来分析碳、氮稳定同位素。碳氮同位素比值分析所用仪器为Carlo Erba NA 2500元素分析仪和Delta Plus同位素质谱仪(中国科学院水生生物研究所), 分析测试结果以δ形式表示, 定义为:δX (‰)=[(Rsample/Rstandard)-1]×1000; 式中, X是13C或15N; Rsample为所测得的同位素比值, 碳同位素是13C/12C, 氮同位素是15N/14N; Rstandard为标准物质的同位素比值, 碳氮稳定同位素测定的标准物质分别为VPDB和N2;δ值用于衡量样品中重同位素的含量, 越小表示样品重同位素(13C或15N)含量越低, 越大表示样品重同位素(13C或15N)含量越高。样品δ13C和δ15N重复测量的标准误差均小于0.3‰。

1.5 数据统计分析

为了分析蜡质标本制作过程对植物碳、氮稳定同位素值的影响, 我们分别对Control和Dry,Dry和AS, 用配对的T检验来检测它们之间的差异。分析后续保存对标本同位素值影响, 由于数据之间方差不齐性, 采用Friedman的非参数检验来判断保存时间对样品的影响。所有的统计工作都是用SPSS(第19版)来完成, 柱状图用Excel完成绘制。

2 结果

沉水植物鲜样中的碳、氮稳定同位素值存在较大的种间差异。金鱼藻的δ13C值最低为(-24.38±0.32)‰, 马来眼子菜的δ13C值为(-19.26±0.35)‰,穗花狐尾藻的δ13C值最高为(-16.76±0.14)‰,δ15N同位素值中最低的是马来眼子菜(0.409±0.11)‰, 穗花狐尾藻(5.67±0.10)‰, 金鱼藻最高达到了(12.48±0.11)‰ (图1)。

与沉水植物鲜样稳定同位素值相比较, 标本的压制过程显著降低了马来眼子菜、金鱼藻和穗状狐尾藻的碳稳定同位素值(马来眼子菜、穗状狐尾藻,P＜0.05; 金鱼藻,P＜0.01, 表1), 氮稳定同位素值只有金鱼藻出现了显著的下降(P＜0.05, 表1)。浸泡过程对3种沉水植物样本的碳、氮稳定同位素均没有显著影响。在6个月的短暂保存实验中, 所有样本的碳稳定同位素都出现了显著变化(马来眼子菜P=0.011, 金鱼藻P=0.010, 穗状狐尾藻P=0.031;图1、表2)。结果表明, 标本的压制过程比浸泡过程对碳、氮同位素值产生的影响更大。沉水植物标本的碳稳定同位素值易受标本制作和保存过程的影响, 而氮稳定同位素值却几乎不受影响(图1)。

通过对样品的碳、氮稳定同位素值差异分析,我们发现不同种类沉水植物δ13C受标本制作和保存阶段的影响不同。在压制过程中马来眼子菜的δ13C降低了1.78‰, 金鱼藻和穗花狐尾藻的δ13C受影响较小, 分别只降低了0.72‰和0.98‰。在浸泡过程中所有植物的δ13C出现一定程度的上升, 穗花狐尾藻的δ13C上升了1‰。保存阶段的植物δ13C则出现了不规律的波动, 总体上为先上升后下降的趋势。植物的δ15N也受标本制作和保存阶段的影响,但相对于δ13C来说影响较小, 差异最大的金鱼藻δ15N降低了1.13‰。浸泡阶段的沉水植物δ15N也呈现上升的趋势。保存阶段的沉水植物δ15N除马来眼子菜在开始的一个月内上升外, 一直保持较稳定的状态(表2)。

不同沉水植物个体间δ13C和δ15N存在较大差异, 其中δ13C从-2.95‰变化到1.41‰, 氮的同位素值从-1.76‰变化到1.42‰。所有沉水植物个体δ13C和δ15N的差异整体呈正态分布,δ13C平均值为-0.37‰,δ15N的平均值为-0.18‰(图2)。

图1 三种沉水植物在制作和保存过程中的碳、氮稳定同位素值(横坐标Control代表鲜样即对照, Dry代表植物干燥后的样品,AS代表浸泡过后的标本, 1W、1M、2M、3M、4M、5M和6M分别代表保存1周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月后的标本)Fig. 1 Effects of press procedure, soak procedure and preservation on three submerged macrophytes δ13C and δ15N values (horizontal axis: Control represents fresh samples, Dry represents dry samples, AS represents soaked samples, 1W, 1M,2M, 3M, 4M, 5M and 6M represent samples during preservation period as 1 week, 1 month, 2 month, 3 month, 4 month, 5 month and 6 month)

表1 植物标本在压制, 浸泡和保存阶段碳、氮稳定同位素差异的显著性情况(“＊”代表0.01＜P＜0.05, “＊＊”代表P＜0.01)Tab. 1 Values of press procedure, soak procedure and preservation of submerged macrophytes analyzed by analysis of variance (ANOVA)(“*” represent 0.01＜P＜0.05，“**” represent P＜0.01)

3 讨论

植物组织中的碳、氮稳定同位素值易受外界影响而发生改变, 实验中我们发现沉水植物标本的碳稳定同位素值在制作和保存过程的影响下变化较大。沉水植物标本的δ13C在压制过程中出现显著的下降, 有一种可能是由于不同的植物体内含有的有机化合物的成分不一样, 在制作和保存标本的过程中, 会与周围的介质发生同位素中重原子和轻原子的交换, 如13C和12C,15N和14N的交换[31—33]。报纸的主要成分是纸浆和墨水[34], 其中碳元素为主要组成成分之一。在压制标本的过程中, 植物体内的有机化合物可能与报纸之间发生了成分交换。或者,在压制的过程中报纸上未完全固定的墨粉压印到植株表面。最终导致植株的δ13C下降。在浸泡的过程中, 植物标本主要是穗花狐尾藻和马来眼子菜的δ13C分别上升了1‰和1.78‰。这有可能是由于干燥的植物标本被浸泡在饱和的氯化汞溶液中的过程中, 植物体内的部分有机化合物如叶绿素[35]被溶解进溶液中。从而导致植物碳稳定同位素值的上升。这也同样可以解释, 为什么植物的碳同位素比氮稳定同位素受的影响更大, 可溶解的有机物都是含碳的, 但是不一定含有氮元素。

用传统方法制作的植物标本, 确实会导致某些植物产生稳定同位素的改变。本实验中所有的沉水植物δ13C都受传统压制过程的影响而下降, 其中马来眼子菜的δ13C下降的幅度最大达到了1.78‰,只有金鱼藻的δ15N在压制过程中出现1.1‰的显著下降。浸泡后的沉水植物标本中只有穗花狐尾藻和马来眼子菜的δ13C分别出现了1.00‰和0.52‰的上升, 金鱼藻的δ13C增长小于0.08‰。浸泡处理使马来眼子菜中平均δ15N上升了近一倍, 从0.27‰到0.60‰, 但是仍然没有显著性差异, 这可能是由于其较大的组内差异导致的。因此, 我们不能得出一个统一的校正因子, 这是由于不同物种稳定同位素对不同的处理阶段的响应存在种间差异导致的。短暂的保存实验, 不足以让植物标本中的稳定同位素固定下来。与δ15N不同, 保存阶段所有植物的δ13C都出现不同程度上的波动, 不同时间的δ13C存在显著差异。先前有研究表明, 动物标本的保存过程中其碳、氮稳定同位素值不会随时间变化[32,36], 但是也有研究表明, 在保存24个月后, 碳稳定同位素会随着时间而变化[33]。对于动物标本, 由于其生物个体的复杂性, 研究结果尚且不一致。对于水生植物来说仍需要对更长时间的单个物种标本保存来研究其影响。

表2 在压制、浸泡和保存标本过程中沉水植物碳、氮稳定同位素的变异值(所有值均是与第一次采集的鲜样做差值。“Δ”代表差值)Tab. 2 The mean values of submerged macrophytes δ13C and δ15N on press procedure, soak procedure and preservation (Values represent mean difference from control values. “Δ” represents difference)

图2 标本压制、浸泡和保存过程中碳、氮稳定同位素值之间的差异Fig. 2 Mean difference of submerged macrophytes δ13C and δ15N values on press procedure, soak procedure and preservation

生态系统中不同对象碳稳定同位素的差异大于3‰。例如, C4和C3植物的稳定碳同位素差异差不多有14‰[37], 在同种环境下,的稳定碳同位素比CO2大7‰[38]。 Angradi等[39]发现藻类的平均碳稳定同位素值为-33‰, 然而陆生植物的碳稳定同位素值接近-23‰。在我们的研究中, 发现植物稳定同位素种间的差异大于3‰。在不同环境下生长的水生植物, 其碳、氮稳定同位素的差异基本都大于3‰[40]。Li等[23]发现不同湖泊生长的苦草的δ13C变化范围从-27.9‰到-17.9‰, 在不同的湖泊中差异大于3‰。在本实验中水生植物标本的δ13C受制作和保存的影响较大, 用δ13C作为分析环境变化的工具可能会得到与历史事实不符的结论。然而,水生植物标本的δ15N只有金鱼藻在压制过程出现δ15N值的显著下降, 保存阶段的δ15N值没有出现显著的变化。因此, 我们认为δ15N可以用于对传统方法制作的水生植物标本的分析。当所研究植物标本的碳、氮稳定同位素的差异大于3‰时, 可以忽略制作和保存过程的影响, 得到的结论的可信度更高。对于历史的、长期的稳定同位素的变化[41,42],需要开展更长时间的校准实验, 而且分析的样品量要足够大, 这样才能尽可能地减少错误结论。