(贵州大学，贵阳 550025)

蓝莓原产于美洲，为杜鹃花科越桔属种子植物，由于其果实含有丰富的花青苷、维生素、氨基酸以及钾、铁、锌、钙等微量元素，营养价值高，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一，并且在医疗保健、化妆品和环境保护等方面应用广泛[2]。因而，现在各地广为引种栽培。

黔东南州是贵州引种栽培蓝莓最早、栽培面积最广的地区，目前引种的蓝莓品种多达9个，是贵州省有机蓝莓生产的主要基地。随着栽培面积的不断增加和栽培时间的延长，蓝莓病害的发生也越来越严重，蓝莓枝枯病就是其中一种主要病害。蓝莓枝枯病造成枝条枯死，严重的影响蓝莓产量和品质，是制约贵州省蓝莓产业发展的重要因素之一。准确鉴定引发贵州省黔东南州蓝莓枝枯病的病原菌，并查清不同蓝莓品种对蓝莓枝枯病的抗病性程度，是绿色防控蓝莓枝枯病的理论基础，是保障有机蓝莓生产，提高果农经济效益的重要举措，对促进贵州省蓝莓产业的发展和果农的脱贫致富具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

从黔东南州麻江县和丹寨县的蓝莓果园(见表1)采集蓝莓枝枯病发病标本，带回实验室进行病原菌的分离、纯化和鉴定，并且进行蓝莓枝枯病的自然发病系统调查和人工接种鉴定。

表1 实验材料

品种名称采集地点奥尼尔麻江县睿林蓝莓基地蓝宇麻江县睿林蓝莓基地粉蓝麻江县睿林蓝莓基地园蓝麻江县睿林蓝莓基地巨峰麻江县睿林蓝莓基地顶丰麻江县恒道丹林蓝莓基地杰兔丹寨县兴仁蓝莓种植基地灿烂麻江县乌羊麻蓝莓标准园巴尔德温麻江县睿林蓝莓基地

1.2 方 法

1.2.1病原菌的分离

采用组织分离法，从蓝莓枝枯病标本的病健交界处切下若干个0.2 cm×0.2 cm左右的组织块，先用75%乙醇进行消毒处理后，再用无菌水漂洗2次，用镊子取出并放在滤纸上吸干水分；放置在PDA培养基上，在25 ℃恒温培养箱中培养。

1.2.2致病性测定

按照柯赫氏法则，通过盆栽试验，采用致伤接种的方法，将分离的微生物接种到健康的蓝莓幼苗枝条上，正常培养该蓝莓植株，等到接种枝条上出现明显的发病症状，再次分离该发病部位的微生物。对比本次分离的微生物与接种时使用的微生物的形态特征，若一致，则确定分离到的微生物为引发蓝莓枝枯病的病原菌。

注：A为成熟的分生孢子；B为PDA上的菌落背面；C为PDA上的菌落正面。图1 棒状拟盘多毛孢形态特征

1.2.3病原菌的鉴定

分别采用形态学方法和分子生物学方法鉴定病原菌。具体如下：

1) 病原菌形态鉴定方法。将分离纯化的病原菌在PDA培养基平板上进行培养，利用光学显微镜观察病原菌产孢结构，分生孢子的形态及着生方式，通过显微镜连接的电脑对分生孢子进行拍摄，并测量分生孢子大小。根据分生孢子的形态及着生方式确定其属、种。

2) 病原菌分子生物学鉴定。病原菌DNA的提取；利用ITS通用引物 ITS 4和 ITS 5对病原菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增，然后送样至上海生工研究中心有限公司进行测序；测序和数据比对。经专业的生物公司测序得到结果后，通过NCBI上的BLAST功能寻找所测序列的近似序列，然后与结果相比对，判断是否一致，从而确定该地蓝莓枝枯病的致病菌。

1.3 不同蓝莓品种对枝枯病的抗病性调查

1.3.1自然发病调查

对黔东南州麻江县和丹寨县栽培的奥尼尔、蓝宇等9个品种、3年生以上的蓝莓植株，根据每个品种蓝莓树木群体的大小，按照5点取样法或3点取样法，进行蓝莓枝枯病自然发病的系统调查；每个调查点，随机取样10株，调查各植株上的全部枝条是否有枝枯病发病。最后统计各品种的病枝率，初步判定这些品种的蓝莓对枝枯病的抗病性程度。

1.3.2人工接种的抗病性鉴定

通过盆栽方法，对奥尼尔、蓝宇、粉蓝、园蓝、巨峰、顶丰、杰兔、灿烂、巴尔德温共9个品种的蓝莓幼苗，以分离纯化的蓝莓枝枯病的病原菌——棒状拟盘多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)为致病菌，采用致伤接种法，进行人工接种鉴定。接种后正常培养蓝莓植株，于3周后进行抗病性调查，确定其抗病性程度。

2 结果与分析

2.1 致病性测定结果

对奥尼尔等9个蓝莓品种上采集到的枝枯病标本上分离到的微生物分别进行致病性测定。接种后，其症状均表现为：在接种处出现红褐色病斑，随后病斑不断扩大变为褐色，最后整个枝条干枯死亡。通过再次分离病原菌的分离及显微镜观察，其分生孢子与自然条件下发病形成的分生孢子形态特征一致。由此可见，该分离所得的微生物就是引发黔东南州蓝莓枝枯病的致病菌。

2.2 病原菌的形态学鉴定

分生孢子梗紧密排列在分生孢子盘内，单个顶生，具胶状粘稠物质；分生孢子呈纺锤形，有5个细胞，具隔膜，中间分隔处较明显[(21.5～25.2)μm×(5.6～6.2)μm]；两端细胞均为无色，较透明，顶部细胞长度为3.0～3.6μm，基部细胞长度为2.9～3.5μm；中间细胞榄褐色，自顶端前2个细胞为深褐色，细胞壁厚，长度为11.0～11.7μm，后1个细胞颜色稍淡，长度5.6～5.9μm；顶生附属丝2～4根，较长，长度为24.2～27.1μm，基部附属丝仅1根，较短，长度为4.8～6.4μm(图1)。并且，从奥尼尔等9个蓝莓品种上采集到的枝枯病标本上分离的微生物，其形态特征一致，初步判定，他们是同一个种的病原菌。

根据病原菌的培养特点和形态特征，确定引起黔南州蓝莓枝枯病的病原菌为拟盘多毛孢(Pestalotiopsis)属真菌，属半知菌亚门(Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、黑盘孢目(Melanconiales)。

2.3 病原菌分子鉴定

通过用引物ITS 4和 ITS 5进行PCR扩增检测分析，得到了长度为527 bp的产物，通过BLAST搜索，与登录号为FJ 517545.1的序列一致性为100%(Query cover为99%，Evalue=0)，这条序列的描述为拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsisclavispora)，结合形态，可以判定这就是引起黔南州蓝莓枝枯病害的真菌棒状拟盘多毛孢。

2.4 不同蓝莓品种对枝枯病的抗病性

通过对黔东南州麻江县和丹寨县栽培的奥尼尔、蓝宇等9个品种蓝莓枝枯病的自然发病调查发现，供试的9个品种均有枝枯病的发生，但是不同品种间，其病枝率差异比较明显(见表2)。其中灿烂的病枝率最低，仅为8.5%；奥尼尔的病枝率最高，达到24.5%。可以初步判定灿烂、杰兔2个品种对蓝莓枝枯病具有一定程度的抗病性。而奥尼尔、巨峰2个品种对蓝莓枝枯病的抗病性程度相对最低；其他5个品种，对蓝莓枝枯病的抗病性程度居中。

人工接种的抗病性鉴定表明，供试的9个品种，对棒状拟盘多毛孢的侵染大多表现为感病(见表2)，仅灿烂、杰兔2品种表现为抗病。

表2 不同品种蓝莓的枝枯病自然发病调查及其抗病性鉴定

蓝莓品种自然发病病枝率(%)人工接种病枝率(%)抗病性程度粉蓝17.5100感病园蓝10.5100感病巨峰23.5100感病顶丰18.5100感病杰兔10.5100抗灿烂8.5100抗巴尔德温21.5100感病蓝宇22.5100感病奥尼尔24.5100感病

3 结论与讨论

经形态学鉴定和分子生物学鉴定，引发贵州黔东南州蓝莓枝枯病的病原菌为棒状拟盘多毛孢。奥尼尔等9个蓝莓品种中，仅灿烂、杰兔2品种对棒状拟盘多毛孢侵染蓝莓引起的枝枯病具有一定程度抗病性。其余的奥尼尔、园蓝等7个品种均对棒状拟盘多毛孢呈感病表型。

蓝莓枝枯病是蓝莓生产中的重要病害之一，在世界各地的蓝莓栽培中广为发生。在世界范围内，蓝莓枝枯病主要是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌引起，其病原菌包括Botryosphaeriacorticis、Neofusicoccumarbuti、Lasiodiplodiatheobromae、N.parvum、N.australe、N.ribis和B.dothidea等[2-5]。在国内，对于引发蓝莓枝枯病的病原菌，也有多种不同的报道。涂磊等研究发现，引发云南引起蓝莓枝枯病的病原菌为子囊菌葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的小新壳梭孢[N.Parvum( Pennycook & Samuels) Crous,Slippers & A. J. L Phillips][6]。徐成楠等认为，蓝莓枝枯病的病原菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)[7]。金义兰等研究结果表明，引发贵州黔东南州蓝莓枝枯病的病原菌是拟茎点霉属真菌(Phomopsissp.)[8]。赵洪海等[9]、路梅等[10]研究发现，引发山东、浙江蓝莓枝枯病的病原菌为棒状拟盘多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)。张国辉等研究发现，引发贵州黔东南州蓝莓枝枯病的病原菌是乌饭树拟茎点霉(Phomopsisvaccinii)[11]。曾尔玲等研究发现，引发贵州省贵阳市蓝莓枝枯病的病原菌是韦斯梅拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisvismiae)[12]。本研究结果与赵洪海等[9]、路梅等[10]的研究结果一致。由此可见，能够引发蓝莓枝枯病的病原菌较多，生产中需要引起高度重视。

田间病害调查是植物抗病性鉴定的重要方法之一，它具有鉴定结果准确、全面等优点。但是，田间病害调查往往是在病圃或病害流行区进行。在本研究中，由于受蓝莓品种栽培的限制，不同品种栽培在不同的蓝莓果园中。因此，本研究中的田间病害调查结果，不可能准确、全面的反映出各品种对枝枯病的抗病性，仅仅可用于初步判断这些品种对蓝莓枝枯病的抗病性程度。结合人工接种的抗病性鉴定，可以认为灿烂、杰兔2品种对棒状拟盘多毛孢侵染蓝莓引起的枝枯病具有一定程度抗病性。另外，由于引起蓝莓枝枯病的病原菌的多样性，本研究的抗病性鉴定结果，可能不一定适合于非棒状拟盘多毛孢引起的蓝莓枝枯病。