吕 娟 赵红梅 孙桂芳 王润青

(郑州市中心医院神经内科,郑州450000)

脑卒中是指脑部血管破裂和阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，常分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中约占80%[1]。脑卒中具有高致病率、高致残率和高死亡率的特点，严重威胁人类的健康，术后康复需要耗费大量的资源[2,3]。目前对不同类型和阶段的脑卒中，缺少有效而统一的治疗方案，因此研究脑卒中有效治疗药物尤为重要[4]。加兰他敏是从石蒜科植物中提取出来的生物碱，临床上主要用于治疗中度阿尔兹海默症和各种记忆功能障碍[5,6]。除了上述用途，加兰他敏还被用于治疗肌无力、肌病、肌肉萎缩症以及与中枢神经系统紊乱相关的感觉和运动功能障碍[7]。加兰他敏是乙酰胆碱受体的配体，与之结合后，引起乙酰胆碱受体结构改变；同时加兰他敏能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱含量增加[8]。目前加兰他敏的研究主要集中在神经退行性疾病和肌肉萎缩方面，也有研究指出加兰他敏影响神经元的功能和存活,具有神经保护作用[9]，但对脑缺血再灌注损伤的研究还未见报道。核因子E2相关因子(Nuclear factor E2 related factor，Nrf2)是抗氧化调节的重要蛋白，当机体受损时，Nrf2通过调节抗氧化蛋白、炎症因子、凋亡蛋白的表达，对机体产生保护作用。本文研究加兰他敏对大鼠脑缺血再灌注后免疫反应和神经再生的影响及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级SD大鼠由广东医学实验动物中心提供。加兰他敏购自苏州麦伦生物；水合氯醛购自上海麦克林；HE染色试剂盒购自北京索莱宝生物；免疫组化试剂盒购自默沙克生物；NF-200、GAP-43、RGMa、Nrf2、HO-1和NQO1一抗，生物素标记的二抗及显色液购自Abcam;大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 ELISA检测试剂盒购自南京森贝伽生物；活性氧ROS检测试剂盒购自碧云天生物。

1.2方法

1.2.1大鼠分组及模型构建 将30只SD大鼠随机分成5组:健康对照组、假手术组、I/R模型组、I/R 加低剂量GAL组(10 mg/kg)、I/R加高剂量GAL组(50 mg/kg)。线栓法建立大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)模型：10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠采取仰卧位固定，在颈正中切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。用动脉夹暂时阻塞颈内动脉，用细线将左侧颈总动脉远心端系牢，轻推栓线至18 mm处。缝合伤口，2 h后拔出线栓。大鼠向一侧移动，提尾对侧前肢内收，表明模型建立成功。

1.2.2HE染色 麻醉大鼠后，剖开胸腔，经主动脉灌注，生理盐水清洗血液，4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定30 min后取材。常规石蜡包埋，切片，用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；苏木素染色5 min，自来水冲洗；盐水乙醇分化，自来水浸泡15 min；加伊红2 min，常规脱水，透明，中性树脂封片。光学显微镜下观察并拍照。

1.2.3免疫组化 PBS清洗后，滴加牛血清，室温孵育1 h；PBS清洗，加一抗，室温下孵育24 h，PBS清洗；加生物素标记的二抗，室温孵育1 h，PBS清洗；加生物素过氧化物酶溶液，室温孵育1 h，PBS清洗；加DAB显色液，显微镜下观察合适时间，蒸馏水清洗2次，阻断显色反应，PBS清洗；中性树胶封片。光学显微镜下观察并拍照，并使用ImagePro Plus6.0分析。

1.2.4Western blot 取少量组织块，用干净的剪刀尽量剪碎，加含PMSF的细胞裂解液，置于冰上裂解30 min。15 000 r/min离心5 min取上清，BSA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液制作蛋白样品。等量的蛋白样品用12%的变性蛋白凝胶分离，转移蛋白至PVDF膜上，TBST清洗。5%脱脂牛奶的封闭液中，室温下孵育1 h；加1∶1 000的一抗，4°C缓慢摇晃过夜，TBST清洗；加二抗，室温孵育2 h，TBST清洗；加显色液，凝胶成像系统中观察并拍照，使用Image Lab软件分析目的蛋白的灰度值，得出相对表达量。

1.2.5ELISA 大鼠处死前，麻醉，从腹主动脉取血。室温静置40 min，2 500 r/min离心10 min，取上层血清，加盐酸稀释。稀释抗体加到96孔板中，4°C过夜，弃孔内溶液，加洗涤液洗3次。加待检测样品，37°C孵育1 h，洗涤；加入新鲜的酶标抗体，37℃ 30 min，洗涤，加底物液显色，避光反应5 min后加终止液。酶标仪下450 nm检测，使用相关软件分析数据。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件统计和分析实验结果，各组数据采用单因素方差分析后，两组间用t检验。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1加兰他敏缓解脑缺血再灌注对大鼠脑组织的损伤 HE染色结果显示，健康对照组和假手术组神经元呈圆形，细胞核着色均匀，细胞排列规则，较少出现死细胞(图1)。I/R模型组染色结果显示，细胞排列不规则，细胞线不清晰，锥体细胞出现大量坏死，细胞质间隙明显变大，出现空泡，神经数目比健康组少(图1)。I/R模型大鼠经GAL加药处理后，CA1区细胞轮廓清晰，细胞排列紧密，数目明显增多(图1)。实验结果表明，加兰他敏抑制脑缺血再灌注诱导的大鼠CA1区组织病变。

2.2加兰他敏上调NF-200的表达 假手术组与健康对照组相比，NF-200阳性细胞数目没有明显的变化(图2)。I/R模型组与假手术组相比，NF-200免疫组化阳性细胞明显减少(图2，P<0.01)。I/R模型加GAL处理后，NF-200阳性细胞明显增加，且GAL加药浓度与NF-200阳性细胞数目呈正相关(图2，P<0.05)。实验结果表明，加兰他敏促进脑缺血再灌注的大鼠脑神经再生。

2.3加兰他敏诱导缺血再灌注大鼠脑损伤部位神经再生 假手术组与健康对照组相比较，NF-200、GAP-43和RGMa的表达没有明显变化(图3，P<0.05)。I/R模型组与假手术组相比，NF-200和GAP-43的表达明显下调，RGMa的表达明显上调(图3，P<0.05)。I/R模型大鼠经GAL加药处理后，NF-200和GAP的表达显著上调，RGMa的表达显著下调(图3，P<0.05)。实验结果表明，通过上调NF-200和GAP-43，促进神经再生。

图1 加兰他敏对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区病理损伤的影响Fig.1 Effects of Galanthamine on pathologic lesion of CA1 in rats with cerebral ischemia reperfusion

图2 加兰他敏对脑缺血再灌注大鼠受损部位NF-200表达的影响

Fig.2 Effect of Galanthamine on expression of NF-200 in damaged part of MCAO rats

Note: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;#.P<0.05,compared with the I/R group.

2.4加兰他敏抑制缺血再灌注诱导的大鼠脑组织炎症反应 假手术组与健康对照组相比，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量没有出现明显变化(图4，P<0.05)。I/R模型组与假手术组相比，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量显著上升(图4，P<0.05)。I/R模型大鼠加GAL后，血液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量显著下降，且促炎因子的含量与GAL 的含量呈负相关(图4，P<0.05)。实验结果表明，加兰他敏能抑制脑缺血再灌注诱导的炎症反应。

2.5加兰他敏对氧化应激相关蛋白表达的影响 假手术组与健康模型组相比，Nrf2、HO-1、NQO-1的表达没有明显的变化(图5，P<0.05)。I/R模型组与假手术组相比，Nrf2、HO-1、NQO-1的表达显著下调(图5，P<0.05)。I/R模型大鼠加GAL后，Nrf2、HO-1、NQO-1的表达显著上调(图5，P<0.05)。实验结果表明，加兰他敏抑制脑缺血再灌注诱导的氧化应激反应。

2.6加兰他敏降低脑缺血再灌注大鼠脑组织中ROS的含量 假手术组与健康对照组相比，脑组织中ROS的含量没有明显的变化(图6，P<0.05)。I/R 模型组与假手术组相比较，ROS的含量显著上升(图6，P<0.05)。I/R模型大鼠加GAL处理后，ROS的含量显著降低，且ROS的含量与GAL的浓度负相关(图6，P<0.05)。实验结果表明，加兰他敏降低脑缺血再灌注大鼠脑组织中ROS的含量。

图3 加兰他敏对脑缺血再灌注大鼠神经再生的影响Fig.3 Effect of Galanthamine on nerve regeneration in MCAO ratsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;#.P<0.05,##.P<0.01 compared with the I/R group.

图4 加兰他敏对脑缺血再灌注大鼠炎症反应的影响Fig.4 Effect of Galanthamine on imflammatory response in MCAO ratsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;#.P<0.05 compared with the I/R group；##.P<0.01 compared with the I/R group.

图5 加兰他敏对氧化应激相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of Galanthamine on expression of oxidative stress related protein related proteinsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;##.P<0.01 compared with the I/R group.

图6 加兰他敏对脑缺血再灌注大鼠脑组织ROS含量的影响Fig.6 Effects of Galanthamine on ROS content in cerebral ischemia reperfusion ratsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;##.P<0.01 compared with the I/R group.

3 讨论

脑缺血再灌注是指脑缺血一段时间恢复血流后，产生一系列反应，使脑组织的损伤加重，甚至是不可逆损伤[10]。MCAO常用于脑缺血生理病理及神经保护的研究[11]。加兰他敏是乙酰胆碱酯酶的选择性抑制剂，主要用于治疗轻中度阿尔兹海默症，可以缓解药物或损伤诱导的认知缺陷[12]。各组大鼠脑组织CA1区HE染色结果显示，加兰他敏缓解脑缺血再灌注诱导的大鼠CA1区组织病变。

NF-200是在神经元细胞质中发现的中间丝，与微管、微丝组成神经细胞的骨架，在细胞中为轴突提供支撑，调节轴突直径，同时对神经传导也有重要作用[13,14]。在神经退行性疾病中，NF-200会被释放到脑脊液和血液中，因此NF-200的免疫染色作为神经细胞轴突损伤的标志[15]。NF-200抗体常用于神经病理学检测，将神经元从神经胶质细胞中区分开来，因此可以用来检测组织中神经元的数目[16,17]。免疫组化检测NF-200的表达，结果显示加兰他敏提升大鼠脑缺血再灌注后CA1区神经元的数目。

GAP-43是轴突膜蛋白，是一种神经特异性的蛋白质，参与神经细胞外生长及突触发育和神经细胞再生，在神经发育和再生过程中高表达[18]。在神经元的研究过程中，常常将NF-200和GAP-43作为神经元轴突的标志[19,20]。RGMa是轴突再生抑制蛋白，与神经生长发育关系密切，如介导排斥性轴突导向信号和神经管闭合，调控神经增殖、分化、诱导生长锥塌陷[21,22]。加兰他敏处理后，NF-200和GAP-43的表达显著上调，RGMa的表达显著下调，表明加兰他敏诱导大鼠脑缺血再灌注后神经再生。

急性炎症反应在缺血再灌注引起的继发性脑损伤中起着重要的作用。缺血灶局部存在大量促炎因子，促进白细胞浸润，释放大量的炎性介质，加重缺血区神经细胞的损伤[23]。P38和JNK激活后，促进炎症因子的产生，而Nrf2能抑制P38、JNK的磷酸化激活[24]。本实验中观察到加兰他敏上调Nrf2的表达，结果与前人研究一致。酶联免疫吸附测定结果显示，加兰他敏加药组促炎因子的含量显著降低，表明加兰他敏抑制脑缺血再灌注诱导的炎症反应。

Nrf2是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥重要的作用，通过调节抗氧化蛋白的表达，使机体免受炎症诱发的氧化损伤[25]。正常情况下，Nrf2在细胞质中被迅速降解，当氧化应激发生时，Nrf2进入细胞核与DNA启动子相结合，启动抗氧化蛋白基因的转录。HO-1和NQO1都是Nrf2下游蛋白，HO-1是血红素氧合酶，催化血红素降解，其产物都有抗氧化损伤的功能。大量研究显示，Nrf2的过表达对脑缺血再灌注损伤具有积极作用。如Miao等[26]研究发现，异黄酮通过上调Nrf2的表达，减轻卵巢切除后大鼠短暂性脑缺血诱导的损伤。Satoh等[27]研究发现，鼠尾草酸通过激活Keap1/Nrf2信号通路，对体内体外实验的神经细胞都有保护作用。Western blot结果显示，加兰他敏加药组Nrf2、HO-1和NQO1的表达均明显上调，表明加兰他敏增强模型大鼠的抗氧化能力。

在生物环境中，ROS是正常的氧气代谢的副产品，在细胞信号和体内平衡中扮演着重要的角色[28,29]。当机体受到压力刺激时，活性氧的含量急剧升高，对细胞结构造成严重损害[30]。目前公认脑缺血再灌注产生大量的ROS是引起再灌注损伤的主要原因[31]。试剂盒检测总ROS，发现加兰他敏能降低大鼠脑缺血再灌注后ROS的含量。

综上所述，加兰他敏通过激活Nfr2/ROS通路，缓解大鼠脑缺血再灌注后的免疫紊乱，诱导神经再生相关蛋白的表达。下一步研究加兰他敏对神经母细胞瘤SH-SY5Y氧化应激的影响及相关分子机制。