孙 林 洪明阳 曹雅明 朱晓彤

(中国医科大学免疫学教研室，沈阳110122)

疟疾是疟原虫通过媒介按蚊传播的威胁人类健康的寄生原虫感染性疾病。WHO报告显示，2017年全球有216万疟疾病例，445 000人死于疟疾感染[1]。抗药原虫与抗杀虫剂蚊的出现与扩散使疟疾的防控面临严峻挑战[2]。探索新型有效的疟疾控制方式迫在眉睫。传播阻断疫苗(Transmission blocking vaccine，TBVs)可阻断流行区疟疾的传播，且由于其候选抗原表达于蚊阶段原虫，不受人体免疫系统选择压力影响，故具有低多态性和良好的免疫原性[3]。现已发现多个疟疾传播阻断疫苗候选抗原，如：配子体和配子表面蛋白P48/45与P230，合子和动合子期表面蛋白P25和P28，蚊阶段原虫表面抗原HAP2[4-7]。虽然上述候选抗原制备的疫苗具有明显的传播阻断效应，但仍不能完全阻断原虫传播。因此，探索新的TBVs候选抗原可为高效疟疾传播阻断疫苗的研制提供前期基础。

疟疾传播始于蚊虫叮咬感染患者。在蚊虫叮咬过程中，配子体期原虫由脊椎动物宿主(人)传播到蚊体内。在蚊胃内，由于温度、pH值下降和多种环境因素导致配子体分化为雄配子(小配子)和雌配子(大配子)[8]。经3次有丝分裂后，每个小配子体形成八个小配子。通过出丝溢出并与大配子结合受精后，形成合子和动合子。上述发育过程依赖原虫体内多条由磷酸酶(PPs)和激酶(PKs)参与的信号转导通路的作用[9-11]。调控配子体期原虫信号转导可干扰原虫在蚊体内的发育，为阻断疟疾传播提供可能。因此，配子体发育信号转导过程中的磷酸酶和激酶为抗疟小分子药物研制的有效靶位，同时也是疟疾传播阻断疫苗的潜在候选抗原。

丝/苏氨酸磷蛋白磷酸酶5(PP5)通过N端的TPR结构域与热休克蛋白90(Hsp90)、Rac GTP酶、RAF、ASK1、CDC16和CDC27等蛋白相互作用，参与细胞信号转导过程[12-14]。在柔嫩艾美耳球虫原虫中，下调PP5(Eimeria tenella PP5，EtPP5)表达水平可导致二代裂殖子凋亡[15]。上调布鲁氏锥虫PP5(Trypanosoma brucei PP5，TbPP5)中PP5表达水平可抑制格尔德霉素的治疗效果，而敲除PP5基因可抑制锥虫生长[16]。恶性疟原虫PP5(Plasmodium falciparum PP5，PfPP5)具有与其他原虫PP5蛋白相似结构，并与Hsp90相互作用，但其功能尚不明确。有研究提示PfPP5在疟原虫生长和信号转导途径中发挥重要作用[17,18]。

基于PP5蛋白在哺乳动物细胞中重要的信号传导作用和其在疟原虫有性阶段研究的潜在意义，本项目采用生物信息学方法选取恶性疟原虫PfPP5在伯氏疟原虫(Pb.ANKA)中同源蛋白PbPP5(PbANKA_113190)，截取其优势抗原表位区域，构建原核表达载体，表达并纯化PP5重组蛋白。免疫小鼠后，通过ELISA和Western blot方法评估PP5蛋白的免疫活性，并通过评估抗PP5免疫血清的传播阻断效果为研制新型高效疟原虫传播阻断疫苗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自北京实验动物研究所；Pb.ANKA 2.34原虫基因组DNA(gDNA)由中国医科大学免疫学教研室保存；KOD-Plus-Neo购自Toyobo；限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0、T4 DNA连接酶购自TaKaRa；快速质粒小提试剂盒(DP105)购自天根；LB Broth、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody HRP、HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、PierceTMECL Plus Western blot Substrate、6×His Tag Monoclonal Antibody购自Thermo Fisher Scientific； 1640培养基购自Gibco；胎牛血清购自Hyclone；氨苄青霉素购自北京鼎国。

1.2方法

1.2.1丝/苏氨酸磷酸酶5(PlasmoDB ID:PbANKA_113190，PP5)基因合成及原核表达载体构建 以Pb.ANKA原虫gDNA为模板，采用引物：PP5-BamHIF：cgcggatccGTTGTAGAATATATAAGTGTACC；PP5-NotIR：ttttccttttgcggccgcAATATTTTGATATAAA-TTATGAGCATA，扩增PP5基因功能区域(氨基酸位点：407-711 aa)。将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化获得PP5-DNA片段后，经BamHⅠ和NotⅠ限制性内切酶37℃孵育2 h，纯化回收双酶切的DNA片段。pET32a(+)原核表达载体采用BamHⅠ和NotⅠ双酶切后回收纯化。采用T4连接酶16℃过夜连接酶切后的pET32a(+)载体和PP5-DNA片段，构建pET32a(+)-PP5表达载体。连接产物转化至宿主菌Rosetta(DE)Competent Cell(TaKaRa)，菌落PCR选取阳性克隆后，质粒小提后，送华大基因公司测序。采用MEGA7.0软件，对测序结果与PlasmoDB(http://www.plasmodb.org)数据库中PP5基因组DNA基因比对分析。

1.2.2重组蛋白的表达、纯化与实验动物免疫 选取pET32a(+)-PP5阳性克隆于LB培养基中，经1 mmol/L IPTG诱导20℃过夜摇菌表达重组蛋白后，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads纯化PP5-his重组蛋白并检测蛋白浓度。将纯化蛋白的重组蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。25 V 30 min 半干法转膜。以5%脱脂奶粉，4℃封闭过夜。TBS-T漂洗3次后，采用抗His标签抗体6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)孵育PVDF膜，室温1 h。用TBS-T将PVDF膜洗涤3次，每次5 min。采用HRP标记的山羊抗小鼠IgG孵育PVDF膜，室温1 h。TBST洗涤3次。用ECL发光方法，荧光图像分析系统中检测结果。实验动物免疫：6～8周龄BALB/c雌性小鼠10只，随机分为2组，每组5只。1组免疫PP5重组蛋白(PP5)；2组为PBS对照组(control)。每两周免疫1次，共免疫3次。初次免疫重组蛋白(50 μg/只)与完全弗氏佐剂充分混合，二免和三免采用重组蛋白与不完全弗氏佐剂充分混合皮下免疫小鼠。 分别于小鼠免疫后14、28、42 d采集免疫小鼠尾血，收集免疫血清，-80℃保存。

1.2.3血清特异性抗体水平检测 用溶解在碳酸盐缓冲液的PP5重组蛋白(10 μg)包被96孔酶标板，4℃过夜。采用含1%BSA的PBS-T封闭l h，以PBS缓冲液连续倍比稀释免疫后不同时间点小鼠抗PP5免疫血清，每孔100 μl，37℃孵育 2 h，PBS-T清洗3次后，加入1∶5 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，孵育l h，PBS-T清洗后，加入底物邻苯二胺和过氧化氢进行显色，酶标仪检测492 nm处OD值。

1.2.4内源性蛋白PP5提取 采用1×107个Pb.ANKA尾静脉注射(i.v.)感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率达5%时取小鼠尾血100 μl，PBS洗涤3次，采用0.015%皂苷裂解红细胞，PBS洗涤去除血红蛋白后，采用2%SDS+0.1%TritonX-100提取原虫蛋白。采用抗PP5免疫血清，Western blot方法检测抗PP5免疫血清与内源性PP5蛋白的结合情况。

1.2.5抗PP5免疫血清对有性阶段原虫生长发育抑制效果观察 采用1×107个Pb.ANKA腹腔注射(i.p.)感染BALB/c小鼠，待感染后第3天，感染率达5%时取小鼠尾血10 μl与40 μl动合子培养基(1640培养基+25%胎牛血清)混合，并将抗PP5免疫血清按1∶5、1∶10、1∶50和1∶100四个稀释浓度分别加入动合子培养基中，放置于25℃培养箱中培养15 min后，取1.5 μl涂片，并在10 min内于光镜显微镜下计数40个视野，观察配子体出丝的数目。取10 μl血液置于90 μl动合子培养液中，加稀释的重组蛋白/对照免疫的小鼠血清(1∶5、1∶10、1∶50和1∶100)。疟原虫在19℃培养24 h。用抗Pbs21抗体固定和标记培养物，在荧光显微镜下计数动合子数目并计算动合子形成率[19,20]。在蚊饲实验中，采用1∶5 倍稀释抗PP5免疫血清100 μl在蚊饲前30 min尾静脉注射1×107个Pb.ANKA感染的BALB/c小鼠，蚊饲10 d后，解剖按蚊检测感染率和蚊胃内卵囊形成情况。

1.3统计学处理 应用GraphPad Prism 6.0统计软件对实验数据进行统计分析，原虫血症的组间比较采用Student′st检验，配子体出丝，动合子转化率，蚊感染率和卵囊密度实验组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1pET32a(+)-PP5载体构建及其表达和纯化 本研究中成功构建了pET32a(+)-PP5原核表达载体，并转至大肠杆菌Rosetta(DE)Competent Cell表达系统，加入1 mmol/L IPTG，经16℃诱导20 h后，SDS-PAGE电泳分析可见大量可溶性PP5重组蛋白(约38 kD)的表达。使用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads柱纯化重组蛋白，并对洗脱及透析后的样品进行Western blot检测，可清晰看到目标蛋白条带约38 kD，大小符合目的蛋白分子量。检测其蛋白纯度>80%，浓度可达到2.5 mg/ml(图1)。

2.2免疫血清特异性IgG抗体检测ELISA结果 小鼠经3次PP5重组蛋白免疫后，与PBS组相比，PP5组小鼠血清特异性抗体水平显著升高(P<0.01，图2A)，且抗PP5免疫血清可与内源性PP5蛋白结合(约82.5 kD)。重组蛋白加强免疫后效价可达1∶256 000。与对照组相比差异具有统计学意义(图2B)。

2.3抗PP5免疫血清对配子体期原虫发育的影响 1∶5、1∶10 、1∶50和1∶100倍稀释的抗PP5免疫血清可使配子体出丝数目分别减少75%、45%、33.33%和21.05%，且减少量呈剂量依赖性，1∶5和1∶10倍稀释组与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)(图3)。此结果提示抗PP5免疫血清可影响雄配子功能。

2.4抗PP5免疫血清对体外动合子期原虫和蚊阶段原虫发育的影响 1∶5、1∶10、1∶50和1∶100倍稀释的抗PP5免疫血清与疟原虫共同培养24 h后均可使动合子形成减少，动合子数目分别减少了77.12%、60.39%、37.58%和20.26%。除1∶100倍稀释组，其他各组与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)(图4A)。动合子转化率实验显示，1∶5 稀释的抗PP5免疫血清可显著抑制动合子转化率，动合子转化率减少14.79%(P<0.05)。同时，与对照组相比，1∶5倍稀释的抗PP5免疫血清可显著降低蚊感染率26.05%，蚊胃内卵囊密度下降74.19%(表1)。上述结果提示抗PP5免疫血清可阻止部分动合子和卵囊的形成和成熟。

图1 PP5重组蛋白表达检测Fig.1 Expression of recombinant PP5 proteinNote：A.The coomassie brilliant blue staining result of recombinant PP5 protein；B.Western blot detection of recombinant PP5 protein by using 6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000 dilution).Arrows indicate recombinant PP5 proteins.

图2 ELISA法检测PP5重组蛋白免疫效果和免疫血清抗体效价Fig.2 Immune effect and immune sera antibody titer of recombinant PP5 protein were detected by ELISA assayNote：A.ELISA assay was used to detect the immune effect of recombinant PP5-his protein.Control.PBS immunized group;PP5.Plasmodium berghei PP5 recombinant protein immunized group.The upper right pannel is the result of endogenous PP5 protein detected by anti-PP5 immune serum(1∶200).The arrow indicates endogenous PP5 protein(～82.5 kD).Pre.Pre-immune serum；B.ELISA assay was used to detect the antibody titer of anti-PP5 immune serum.Pre-immune,pre-immune serum.*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

图3 抗PP5免疫血清对配子体出丝的影响Fig.3 Effect of anti-PP5 serum on gametocyte exflagellationNote：PBS control.PBS immunized group;PP5.Recombinant Plasmodium berghei PP5 protein immunized group.*.P<0.05.

图4 抗PP5血清对动合子数目和形成率的影响Fig.4 Effect of anti-PP5 serum on ookinete number and ookinete conversion rateNote：A.The effect of anti-PP5 serum on ookinete number;B.The effect of anti-PbPP5 serum on ookinete conversion rate.PBS control.PBS immunized group;PP5.Recombinant Plasmodium berghei PP5 protein immunized group.*.P<0.05.

表1 抗PP5免疫血清接种小鼠传播阻断效应

Tab.1 Transmission-blocking effects of mouse inoculate with anti-PP5 sera

PBS control seraPBS-M1PBS-M2PBS-M3anti-PP5 seraPP5-M1PP5-M2PP5-M3Mosquitoes infected/dissected20/2322/2320/2313/2315/2316/23Prevalence of infection(%)a86.9595.6586.9656.5265.2269.57Mean prevalence(%)89.8263.77Reduction in prevalence(%)b26.051)Oocyst intensityc129.95117.6103.651532.4743.1875SEMd23.3322.7815.973.3948.04411.09Mean oocyst intensity117.0730.22Reduction in oocyst intensity(%)e74.191)

Note：1)P<0.05 for comparisons between the experimental group and the control group；a.The prevalence of infection was calculated by the number of mosquitoes with oocysts/total mosquitoes dissected in each group × 100%；b.The percent reduction of prevalence was calculated as %mean prevalence PBS control-%mean prevalence anti-PP5；c.Mean number of oocysts per mosquito midgut；d.Standard error of the mean；e.The percent reduction in oocyst intensity was calculated as(mean oocyst intensity PBS control-mean oocyst intensity anti-PP5)/mean oocyst intensity PBS control×100%.

3 讨论

疟原虫的有性发育阶段由配子体转变为动合子的过程中需要多种信号转导通路共同作用，包括由蛋白激酶(Protein kinases，PK)和磷酸酶(Protein phosphatases，PP)催化的可逆蛋白磷酸化过程。PK已被广泛研究并被确认为疟疾治疗的重要靶位，但对于PP的研究尚处于起步阶段。疟原虫的磷酸酶可分为蛋白磷酸酶(Phosphoprotein phosphatases，PPPs)、金属依赖性蛋白磷酸酶(Metal-dependent protein phosphatases，PPM)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)和NLI相互作用因子样磷酸酶(NIFs)等四大家族[21]。PPPs由PP1、PP2A、PP2B、PP5和PP7 等亚家族组成[22]。恶性疟原虫PP1和PP2A在无性发育阶段表达，敲除PP1可抑制DNA合成[23]。小分子药物FKBP35可抑制PP2B磷酸酶活性[24]。PP7家族成员PPJ蛋白主要表达在裂殖体期原虫，其活性有Ca2+调控[25]。但PP5的研究尚处于起步阶段。本研究中，我们选取恶性疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶PP5在伯氏疟原虫中的同源蛋白，探讨其免疫血清对疟原虫有性阶段生长发育的影响。

除采用药物治疗疟疾感染之外，开发高效的疟疾传播阻断疫苗亦是疟疾防控的重要手段[26]。本研究中，采用大肠杆菌系统表达的重组蛋白免疫小鼠，经过三次免疫后，小鼠血清中抗PP5特异性抗体水平显著升高。同时，Western blot结果显示抗PP5免疫血清可以结合内源性PP5蛋白。此结果表明伯氏疟原虫PP5重组蛋白免疫血清具有良好的免疫原性和抗原性，为筛选其作为传播阻断疫苗候选抗原提供了理论基础。经典的TBVs候选抗原，如：配子受精前期靶抗原P45/48、P230，受精后期靶抗原P25、P28和 蚊 虫 中 肠 靶 抗 原HAP2均为原虫有性阶段表面蛋白。虽然P45/48和P230具有明显的传播阻断效果，但两者在体外表达时无法正确折叠而阻碍了其发展[27]。P25和P28为动合子表面蛋白，介导动合子侵入胃壁上皮细胞[28]。有研究证实，抗Pbs25/28免疫血清可完全阻止疟原虫在蚊体内的发育[29]。Pvs25已经进入了Ⅰ期临床试验，Pvs25疫苗可减少80%的卵囊形成，并降低20%～30%的按蚊感染率，但其传播阻断效果未达到100%。本课题组前期研究发现，PP5蛋白在动合子期定位于伯氏疟原虫表面(结果未显示)。当在动合子培养基中分别加入1∶5、1∶10、1∶50和1∶100的抗PP5免疫血清时，其对动合子形成的抑制效果呈剂量依赖性，动合子形成率分别减少了77.12%、60.39%、37.58%和20.26%。在同样的高抗体浓度下(1∶5倍稀释)，其动合子抑制率与经典的伯氏疟原虫HAP2候选抗原相似(抑制率：87%)[7]。同时，蚊饲实验显示，抗PP5免疫血清可显著抑制蚊感染率和胃内卵囊形成。前期研究中，本课题组发现伯氏疟原虫PP5蛋白在多个原虫发育阶段表达，提示抗PP5的抗体可在多阶段阻止疟原虫的生长发育。前期研究的免疫荧光结果显示，PP5蛋白表达于红内期和配子体期原虫胞浆。由于红内期晚期和配子体期细胞膜的高通透性可使免疫血清中特异性抗体进入细胞内部，进而与特异性抗原结合。因此，抗PP5蛋白的免疫血清可能影响原虫生长发育的多个阶段。与预期结果一致，在1∶5和1∶10倍稀释免疫血清加入培养基后，与对照组相比雄配子体出丝水平明显下降。抗PP5免疫血清对红内期原虫生长发育的作用尚需深入研究。

综上所述，我们应用抗PP5免疫血清，通过使用鼠疟模型确定了伯氏疟原虫PP5作为新的TBVs候选抗原的传播阻断能力，为TBVs的研发提供了一定的理论与实验素材，并为恶性疟原虫和间日疟原虫PP5蛋白作为疟疾传播阻断疫苗候选抗原可行性的深入研究奠定了理论基础。