潘争艳 邱福林 吕桂兰 马秀芳 商文奇 白元俊,* 徐正进



辽宁省粳稻品种稻瘟病抗性基因分析

潘争艳1,2邱福林1吕桂兰1马秀芳1商文奇1白元俊1,*徐正进2,*

(1辽宁省水稻研究所, 沈阳 110101;2沈阳农业大学 农学院, 沈阳 110866;*通讯联系人, E-mail: cycbyj@126.com; xuzhengjin@126.com)

【目的】为明确辽宁省260份粳稻品种中稻瘟病抗性基因的类型，评价抗性基因利用价值，为辽宁省水稻抗病育种提供参考。【方法】选用9个稻瘟病抗性基因的特异引物分析辽宁省已审定的260份粳稻品种抗性基因种类、基因组合类型及地域分布情况，基于抗病基因检测条带的有无进行品种聚类分析，苗期人工喷雾接种、分蘖盛期和蜡熟期田间自然发病调查，评价9个抗性单基因系的抗病性。【结果】辽宁省粳稻品种中含有抗性基因数量从0~7个不等，抗性基因检出率最高，其次是和；所有参试品种均未检测到基因，仅在辽宁省农业科学院育成的辽粳421中检测到基因。参试的水稻品种中共有62个基因组合类型。基于抗性基因检测结果进行聚类分析，可以将260份粳稻材料分为11个类群。9个抗性单基因系中，抗性最好；其次是和。【结论】抗性基因、和在辽宁省粳稻品种选育和生产上具有重要的应用潜力；参试品种的80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ类群，没有明显的地域差异；参试品种抗病基因组合类型不够丰富，亲缘关系较近。

粳稻；稻瘟病；抗性基因

辽宁省水稻品种经历了7~8次的更新，每一次品种的更新水稻产量随之提高10%左右，为辽宁省的粮食生产提供了保障[1]。但目前辽宁粳稻品种存在一些问题，审定的品种和骨干亲本亲缘关系较近、遗传基础相对单一[2-3]；抗病品种抗谱较窄、抗病基因型不明确[4-5]等。如何选择骨干亲本、延长选育品种的使用寿命、提高品质、增强品种抗性是目前辽宁省水稻品种选育中亟待解决的问题。

稻瘟病是阻碍水稻高产、稳产的主要因素之一，从20世纪90年代开始，全国稻瘟病发病面积年均超过4 千万hm2，造成的损失高达10 亿kg[6]。抗病品种选育是防治稻瘟病有效方法之一，稻瘟病抗性基因的多少又决定了亲本在育种中的应用范围。随着分子标记技术的发展，全世界已鉴定了100多个稻瘟病主效基因及QTL位点，在水稻第6染色体位点至少有10个不同的等位抗性基因，其中、和基因有较好的利用价值而被广泛利用[7-10]。

本研究选择了、、、、、、、和共9个抗性基因特异引物对260份已审定的辽宁省粳稻品种进行稻瘟病抗性基因检测，分析抗性单基因系的苗期、分蘖盛期和蜡熟期的抗病性，并对抗性基因利用价值进行评价。

1 材料与方法

1.1 供试材料

辽宁省各地区育成审定的品种260份（由辽宁省水稻研究所保存繁育）。2017年4月20日播种，5月25日移栽，常规管理。分蘖盛期采集叶片，进行抗性基因分析。9个抗性单基因系由辽宁省农业科学院植物保护研究所提供。

表1 引物信息

1.2 DNA提取及PCR扩增

利用CTAB法提取总DNA，以总DNA为模板，引物信息见表1。

PCR体系如下：DNA模板2 μL，正反引物各2 μL，酶10 μL，加ddH2O至总体积20 μL。PCR程序如下：95℃下预变性5 min；95℃下变性30 s，退火，72℃下延伸，35个循环；72℃下延伸10 min。PCR产物在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳1.5 h，在凝胶成像系统下拍照。

1.3 单基因系抗性鉴定

1.3.1 稻瘟病菌来源

苗期人工喷雾接种单个菌株，38株具有强致病性的菌株分离自辽宁省4个生态稻区，其中辽宁中部平原稻区9株（沈阳市，辽宁省水稻研究所）、辽河平原三角洲盐碱稻区4株（辽宁省盘锦市大洼县东风镇东风农场）、辽北平原中早熟稻区6株（辽宁省铁岭市农业科学院）和辽宁东南沿海晚熟稻区19株（东港市示范农场），所有菌株均为辽宁省农业科学院植物保护研究所提供。

1.3.2 稻瘟病菌活化、繁殖及产孢

菌株产孢方法参考汪文娟[21]和褚晋[22]等方法，菌株的活化培养基为PDA培养基，产孢培养基为玉米粒培养基。菌株块接种到玉米粒培养基至玉米粒表面长出大量气生菌丝，用无菌水洗去气生菌丝并进行保湿处理，待产生足够多的分生孢子后，无菌水洗下孢子，配制成浓度为1.5×105个/mL接种用孢子悬浮液。

1.3.3 抗性单基因系苗期抗性评价

单基因系水稻种子经浸种、催芽后每9个品种播种于一个塑料育苗盘内（育苗土为灭菌后的育苗基质），每育苗盘内设丽江新团黑谷为感病对照。待稻苗长到4~5叶期时进行喷雾接种。每育苗盘喷雾50 mL孢子悬浮液。接种后，将育苗盘放置于25℃接种室内保湿24 h，然后移至温室，25℃~28℃下保湿培育。接种7 d后，感病对照充分发病，调查所有材料的发病情况。

1.3.4 抗性单基因系田间抗性评价

分别在辽宁省农业科学院、盘锦市大洼县东风镇东风农场、铁岭市农业科学院和东港市示范农场设立田间自然诱发抗病鉴定圃，均以丽江新团黑谷为感病对照。于分蘖盛期和蜡熟期调查记载叶瘟和穗瘟发生情况。

1.3.5 抗性单基因系利用价值评价

抗性单基因系的利用价值评价采用抗性频率、发病率及抗性综合指数法[23]。

抗性频率(%)=(接种后表现抗的菌株数/接种总菌株数)×100；穗瘟或叶瘟发病率(%)=(发病穗或叶数/调查总穗或叶数)×100；综合指数=叶瘟病级×0.25+穗瘟病级×0.25+穗瘟损失率×0.5。

M−DL2000。A−YL155/YL87Pita；B−YL183/YL87Npita；C−Pikh；D−Pi40。泳道1~15分别为辽星1号~辽星8号、辽星10~辽星16；从上到下对照分别为Pita、Pita、Pikh和Pi40单基因系。

Fig. 1. Detection results of,andof some rice varieties in Liaoning.

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2013进行数据处理，用SPSS 20.0数据分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 辽宁省粳稻品种携带抗性基因类型及地域分布情况

利用12对稻瘟病特异引物检测了辽宁省260个粳稻品种中携带的抗性基因类型，未检测到基因，其余8个抗性基因在辽宁省粳稻品种中均有分布。抗性基因检出率最高，为84.23%，其次是和。在基因簇的4个基因中，抗性基因的检出率最高，为37.69%，其次是，检出率为0.38%，仅在辽宁省农业科学院育成的辽粳421中检测到(表2和图1)。

辽宁省各地域粳稻品种抗病基因种类和优势基因也存在差异。在辽宁农业科学院育成的粳稻品种中，8个稻瘟病抗性基因、、、、、、和均有分布，优势抗性基因为。盘锦地区及盐碱地研究所、沈阳农业大学、丹东地区、抚顺地区、东亚种业和营口地区育成的粳稻品种含有除外的其余7个稻瘟病抗性基因。盘锦地区及盐碱地研究所选育的品种中的优势抗性基因为和；沈阳农业大学、东亚种业和营口地区选育的品种中的优势抗性基因为和；丹东地区和抚顺地区优势抗性基因为、和。铁岭地区和开原地区育成的品种含有除和之外的其余6个抗性基因，铁岭地区优势抗性基因为、和；开原地区优势抗性基因为。庄河地区育成的品种共含有5个抗性基因，优势抗性基因为、和。

2.2 辽宁省粳稻品种含有抗性基因数量及基因组合类型分析

260份水稻品种含有的基因数量从0~7个不等（表3）。盐粳933和富友33含有除和之外的7个抗性基因。辽粳390等10个品种含有6个抗性基因和6个基因类型，分别是辽粳390不含；丹旱稻4号不含；美锋9号、福粳8号、民喜9号、富粳357和桥科951不含；晨宏36不含；辽粳212不含；盐粳377不含。港稻1号等16个品种含有5个抗性基因和10个基因组合类型。丰民2102等46个品种含有4个抗性基因和13个基因组合类型。中丹4号等90个品种含有3个抗性基因和17个基因组合类型。盐粳68等72个品种含有2个抗性基因和10个基因组合类型。沈农265等20个品种含有1个抗性基因和4个基因组合类型，其中，丰民2102、丹粳10号、辽盐282、沈农611、营8433、富禾5号、沈稻5号、沈稻6号、沈农8801、沈稻4号、辽盐糯10号和沈农91只含有，沈农159、盐丰47、抚粳2号、清选1号和盐粳22只含有；沈香糯1号和沈农265只含有；旱9710只含有。旱糯303、辽粳27、沈农702和沈农87-913不含有检测的9个抗性基因。

参试的水稻品种中共检测到62个抗性基因组合类型，无明显的地区差异。其中含有7个基因组合类型的品种超过10个，占总数的45.77%。东选2号等28个品种基因组合类型为和；庄育3号等11个品种基因组合类型为、和；沈稻81等19个品种基因组合类型为、和；辽粳534等13个品种基因组合类型为、、和；丰民2102等13个品种基含有基因；辽丰4号等24个品种基因组合类型为和；辽粳6号等11个品种基因组合类型为、和。参试水稻品种平均4.19个品种抗性基因类型是一样，抗病基因组合类型不够丰富。

参试品种中糯稻和旱稻携带的抗性基因相对较少，260个品种中有糯稻品种12个，其中含有2个及以下抗性基因的品种有8个，占糯稻总数的66.67%。旱稻品种11个，含有2个及以下抗性基因的品种有6个，占旱稻品种的54.55%。

2.3 辽宁省粳稻品种基于稻瘟病抗性基因检测聚类分析

对260份辽宁省粳稻品种进行聚类分析（表4），抗病基因检测有条带的为1，无条带的0，以欧氏距离15为阈值，可以将260份水稻品种分成11个类群。第Ⅰ类群包括港稻1号等11个品种，含有抗性基因、和，不含有、、和。第Ⅱ类群包括辽粳390等10个品种，含有、、和，不含有和。第Ⅲ类群包括盐粳377等6个品种，含有、、和，不含有和。第Ⅳ类群包括祥丰00-93等5个品种，含有、和，不含、和。第Ⅴ类群包括营9207等95个品种，含有，不含有和。第Ⅵ类群包括辽星10号等26个品种，含有，不含有、、、和。第Ⅶ类群包括花粳45等50个品种，不含、、和。第Ⅷ类群仅包括丹粳12、辽星21和美锋518，含、和，不含、和。第Ⅸ类群包括营稻1号等38个品种，含，不含、、和。第Ⅹ类群包括沈稻10号和公字1号，含和，不含、、、、和。第Ⅺ类群包括辽粳92-34等14个品种，含，不含、、和。

表2 9个稻瘟病抗性基因地域及品种分布频率

LNRRI, Liaoning Rice Research Institute; PY, Panjin area and Liaoning Provincial Saline-Alkali Land Utilization and Research Institute; SN, Shenyang Agricultural University.

表3 辽宁省粳稻品种所含目标基因数目及其所占比率

参试的260份水稻品种80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ类群。其中，第Ⅵ类群中沈阳农业科学院育成的品种仅千重浪1号；丹东地区育成的品种在第Ⅶ类群有2个品种，在第Ⅸ类群有10个品种；盘锦地区及盐碱地研究所育成的品种在第Ⅶ类群有13个品种。类群中品种数量地域分布不均，没有明显的地域差异。

表4 基于抗病基因检测的聚类分析结果

2.4 抗性单基因系抗病性评价

采用辽宁省4个生态稻区分离的38株强致病力稻瘟病菌对等9个抗性单基因系进行苗期接种鉴定。结果表明，9个抗性单基因系抗性频率均高于丽江新团黑谷的抗性频率（13.16%）。抗性频率大小依次为、、、、、、、和（表5）。

分蘖盛期和蜡熟期对4个田间自然诱发抗病圃的单基因系叶瘟和穗瘟进行调查，9个抗性单基因系抗性均优于LTH的抗性。其中，抗性单基因系、、、和抗性较好，综合指数均小于2，达到抗（R）及以上级别。抗性单基因系抗性最差的，最高发病级别为7级，出现在DG穗期，综合指数为6.5，达到感病（S）级别。抗病单基因系、、、和在辽宁省有很好的利用价值，尤其更适合盘锦和铁岭两个生态稻区推广利用。

3 讨论

近20年来，稻瘟病平均每4~6年大发生一次，造成了严重的经济损失，利用抗性基因培育抗性品种是解决这一问题的主要办法。为了明确辽宁省粳稻品种稻瘟病抗性基因类型，本研究选用了9个稻瘟病抗性基因的特异引物对260个已审定品种进行检测，并分析了9个抗性单基因的抗病性。研究表明，辽宁省粳稻品种含有的基因数量从0~7个不等，抗性基因分布频率最高，其次是和。基因簇的抗性基因分布频率均较低，仅辽粳421检测到，未检测到任何品种中含有基因。Tian等[24]认为抗病基因尚未在中国籼稻品种中广泛应用。汪文娟等[21]认为华南328个杂交稻组合中不携有抗病基因。本研究结果与两者的结论相符。基因簇的4个抗性基因对分离自辽宁省4个生态稻区的病原菌表现较强的抗性，抗性频率为57.89%~89.47%，田间自然抗性情况表现为抗（R）及以上级别，与刘士平等[25]、吴宪等[26]、褚晋等[22]研究发现抗性基因对菲律宾、吉林、云南等地的病原菌均表现高抗性的结果一致。由此可以推断基因簇的4个抗性基因在辽宁省水稻抗病育种中利用价值较高。

对于新品种而言，其产量、品质和抗性的突破主要依赖其亲本材料遗传多样性的丰富程度。翟荣荣等[27]利用均匀分布于水稻12条染色体上的48对SSR引物可将浙江省主要推广种植的10个常规晚粳稻品种划分为两类。张云等[28]用SSR标记分析中国水稻两用核不育系现有骨干亲本材料的遗传多样性。本研究基于抗性基因检测结果进行聚类分析，将辽宁省已通过审定的260份粳稻材料分为11个类群，80.38%集中在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ类群，参试品种共有62个基因组合类型，其中辽丰4号等24个品种，辽盐9号等28个品种以及沈稻81等19个品种的抗稻瘟病基因型完全相同，说明参试的260份水稻品种抗病基因组合类型不丰富，亲缘关系较近，差异较小。

利用分子标记辅助选择技术开展稻瘟病抗性育种取得较大进展。聂元元等[29]将稻瘟病抗性基因、和导入到三系杂交稻恢复系R225，稻瘟病抗性显著高于各自的轮回亲本。张晓慧[30]将MP水稻材料中的广谱抗稻瘟病基因片段导入空育131染色体组中，提高空育了131对稻瘟病的抗性。在本研究选定的9个抗病基因基础上分析，辽宁省粳稻品种尤其是糯稻和旱稻品种抗性选育上应选择遗传关系较远的材料或者引入携带、、和基因的品种作为亲本材料。

表5 抗性单基因系田间自然抗病性评价

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Analysis of Rice Blast Resistance Genes inRice Varieties in Liaoning Province

PAN Zhengyan1,2, QIU Fulin1, LÜ Guilan1, MA Xiufang1, SHANG Wenqi1, BAI Yuanjun1,*, XU Zhengjin2,*

(,Corresponding author,:)

【Objective】To clarify the rice blast resistance genes in 260rice varieties in Liaoning Province, evaluate their utilization value, and provide reference for rice breeding,【Method】specific primers of nine rice blast resistance genes were selected to analyze the species, the quantity and the geographical distribution of resistance genes of 260rice varieties in Liaoning,and the cluster analysis of varieties was based on the detection bands of disease resistance genes. The disease resistance of the nine resistant mongenic rice lines was evaluated by seedling-spray inoculation, natural disease investigation during the active tillering stage and ripening stage.【Result】The number of blast resistance genes inrice from Liaoning varied from 0 to 7, and the frequency ofgene ranked highest, followed by theand.gene was not detected in all tested varieties, andgene was only detected in Liaojing 421 bred by the Liaoning Academy of Agricultural Sciences.There were 62 gene combinations in the rice varieties tested,and based on the clustering analysis of the results of the resistance gene detection, 260rice materials can be divided into 11 groups. Among the nine resistant mongenic lines,showed the best resistance, followed by,and.【Conclusion】The resistance genes,,, andhave important application potential in breeding in Liaoning Province. 80.38% of the tested varieties concentrate in groups V, VI, VII and IX.There is no obvious geographical difference; the types of disease resistance gene combinations of the tested varieties are relatively less abundant and the genetic relationship is relatively close.

rice; rice blast; resistance gene

S435.111.4+; S511.022

A

1001-7216(2019)03-0241-08

10.16819/j.1001-7216.2019.8071

2018-06-10；

2018-10-18。

辽宁省博士后项目(178150); 国家水稻产业技术体系沈阳综合试验站(CARS-01-50); 辽宁省农业领域青年科技创新人才项目(2014023)。