杨清举，张 弘

（1.四川省金堂县第一人民医院·四川大学华西医院金堂医院，四川 成都 610400；2.成都瑞特恩科技有限公司，四川 成都 611731）

依达拉奉（edaravone），化学名3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉-5-酮，是以苯肼和乙酰乙酸乙酯为原料合成的吡唑啉酮类化合物，是首个用于治疗急性缺血性脑卒中的强效自由基清除剂，可作用于脑梗死前期，抑制脑水肿，缩小脑梗死区面积，减轻神经症候群的程度，保护脑组织结构和功能[1-5]。近年来，有关依达拉奉治疗肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病[6-8]等的临床研究正在进行，而其抗癫痫、抗类风湿关节炎和抗纤维化作用开发前景广阔[9-10]。该药自2001年由日本三菱田边制药公司研发上市后，在全球范围内得到了广泛使用。药物制剂中有关物质的检测是其质量研究的重要方面，现参考国内外文献[11-15]，建立高效液相色谱(HPLC)法测定依达拉奉注射液中有关物质含量，以促进该制剂质量的提高。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型和1160型高效液相色谱仪（美国Aglient公司）。

1.2 试药

依达拉奉注射液（成都天台山制药有限公司，批号分别为 140101，140201，140202，140203）；依达拉奉对照品（中国食品药品检定研究院，纯度99.9%）；杂质P1（纯度 99.63% ）、杂质 P3（纯度 99.07% ）均由成都瑞特恩科技有限公司提供；双吡唑啉酮（Alfa Aesar A Johnson Matthey Company，纯度为 98.00% ）；依达拉奉三聚物（深圳振强生物科技有限公司，批号为 Z20130225）。磷酸二氢铵、磷酸均为分析纯，甲醇为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Tianhe Kromail C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：以 0.02 mol／L 磷酸二氢铵溶液 - 甲醇（55 ∶45，V／V，用 20% 磷酸溶液调 pH 至 3.0 ）为流动相 A，以 0.02 mol／L 磷酸二氢铵溶液 -甲醇（25 ∶75，V／V，用 20%磷酸溶液调pH至3.0）为流动相 B，梯度洗脱程序见表 1；流速：1.0 mL ／min；柱温：35 ℃ ；检测波长：245 nm；进样量：20 μL。

表1 梯度洗脱程序（%）

2.2 溶液制备

系统适用性溶液：1）双吡唑啉酮贮备液，称取双吡唑啉酮对照品约 12.5 mg，置 25 mL容量瓶中，加 N，N-二甲基甲酰胺超声使溶解并稀释至刻度，再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。2）杂质P1贮备液，称取杂质P1对照品约10 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。3）杂质 P3贮备液，称取杂质 P3对照品约 12.5 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。称取依达拉奉对照品5 mg，置100 mL容量瓶中，精密加入上述3种贮备液各1 mL，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。因三聚物结构式的空间位阻较大，不易形成，且在本品稳定性研究中三聚物均未检出，故将三聚物按未知杂质控制。三聚物对照品只用于色谱条件专属性研究。

供试品溶液：精密量取依达拉奉注射液3.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

自身对照溶液：精密量取供试品溶液0.5 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

空白辅料溶液：按依达拉奉注射液处方比例及工艺，制得不含依达拉奉的溶液，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取空白辅料溶液、系统适用性溶液及供试品溶液各20 μL，进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。结果空白辅料对各有关物质的测定均无干扰，依达拉奉与各已知杂质（双吡唑啉酮、三聚物、杂质P1和杂质P3）之间分离均良好，杂质与杂质间的分离度均符合要求，依达拉奉峰与杂质P3峰的分离度为3.94，表明本方法的专属性良好。色谱图见图1。

破坏性试验：取样品（批号为 140101）1.0 mL，共5份，分别置5个25 mL容量瓶中，进行不同条件下的降解试验。第1份为未经破坏的样品；第2份加10%H2O21 mL，80℃水浴中放置15 min，作为氧化破坏试验样品；第3份加6 mol／L HCl 1 mL，于80℃水浴中加热26.5 h后调pH至7.0，作为酸破坏试验样品；第4份加6 mol／L NaOH 1 mL，于 80℃水浴中加热 5 h后调 pH至 7.0，作为碱破坏试验样品；第 5份加水 5 mL后置80℃水浴中加热25.5 h，作为热破坏试验样品。上述5种条件下的样品均用流动相A定容。另取2.2项下空白辅料溶液1.0 mL进样。结果空白辅料在主峰相对保留时间约0.35倍处有峰出现，但酸、碱、热及氧化条件下降解产物保留时间均在辅料峰后，表明测定有关物质时，可扣除辅料峰，即主峰相对保留时间约0.35倍之前的峰。结果显示，不同破坏性条件下产生的杂质对依达拉奉有关物质的测定无干扰，且各降解产物之间及与主峰之间的分离均较好，物料平衡，辅料无干扰且无明显降解产物；在酸、碱、热条件下，样品较稳定。表明拟订色谱条件能有效检出本品有关物质。色谱图见图2。

检测限和定量限：取样品及各已知杂质对照品适量，加甲醇溶解作为各贮备液，取适量，用流动相A逐级稀释，进样量均为 20 μL。当信噪比(S／N)为 10 ∶1时，测定定量限；当 S／N为3∶1时，测定检测限。结果各杂质的检测限均较低，本品拟订的进样质量浓度为0.45 mg／mL，进样体积为 20 μL；S ／N 为 3 ∶1，能保证含量大于0.02%的杂质能被检出；能保证样品中含量大于 0.01%的未知杂质、0.006%的双吡唑啉酮、0.001% 的 P1、0.01% 的 P3、0.01% 的三聚物被检出。表明拟订进样量及进样质量浓度能保证本品各杂质的有效检出，满足质量控制要求。

图1 专属性试验高效液相色谱图

图2 破坏试验高效液相色谱图

线性关系考察：分别称取依达拉奉对照品及各已知杂质对照品适量，分别用甲醇和流动相A溶解并稀释制成系列质量浓度溶液，分别进样20 μL，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程与线性范围，详见表2。可见，依达拉奉、双吡唑啉酮、杂质 P1、杂质P3及三聚物的线性关系均较好，r≥0.999 6。

表2 线性关系考察结果

加样回收试验：精密量取样品（批号为 140101）3.0 mL，置 10 mL容量瓶中，按样品定量限 80%，100%，120%的量加入杂质对照品溶液。按2.1项下色谱条件测定有关物质，每个浓度平行测定3次。结果见表3，各已知杂质不同质量浓度的平均回收率均在99.46% ～101.57%之间，RSD 均小于 4.1%（n＝9）。

精密度试验：取样品（批号为140101）适量，按2.2项下方法分别制备6份供试品溶液和0.5%对照品溶液，依法测定有关物质含量，检出结果基本一致，表明本方法重复性良好。杂质P1、杂质 P3、双吡唑啉酮、未知杂质及总杂质的 RSD均小于2.4%；由不同试验人员分别建立不同色谱系统，分别连续测定6份同批（批号为140101）样品，结果12份样品的有关物质检出结果基本一致，表明本方法精密度较好。分别取依达拉奉对照品和各已知杂质对照品适量，用甲醇和流动相A溶解并稀释成一定浓度的溶液，连续进样6次。结果进样精密度良好，已知杂质对照品溶液、自身对照溶液峰面积的 RSD均小于0.9%(n＝6)。

表3 加样回收试验结果（%，n＝9）

稳定性试验：1）对照品溶液，取杂质P1、杂质P3对照品各适量，用甲醇和流动相A溶解并稀释至分别含4，1 μg／mL 的溶液，室温放置 0，1.0，2.5，4.0，6.0，7.0，8.0 h 后取 20 μL 进样，记录色谱图；取依达拉奉对照品、双吡唑啉酮对照品各适量，用甲醇（其中双吡唑啉酮用 N，N-二甲基甲酰胺溶解）和流动相A溶解并稀释成质量浓度为1 μg／mL的溶液，将该杂质对照品溶液室温放置 0，2，4，6，7，8 h 后取 20 μL 进样，记录色谱图；结果各杂质峰面积的 RSD均小于1.1%(n＝6)，说明各对照品溶液室温放置8 h稳定。2）供试品溶液及自身对照溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液和自身对照溶液，分别在室温下放置 0，2.5，5.3，8.0，14.3，18.5 h后，取20 μL进样，记录色谱图，并按主成分自身对照法计算峰面积的 RSD值。结果各杂质峰面积的 RSD均小于5.0%（n＝6），表明供试品溶液及自身对照溶液室温放置18.5 h稳定。

耐用性试验：在2.1项下色谱条件基础上，分别对流动相的组成及pH、流速、柱温、检测波长进行耐用性考察。由于杂质P3与主峰最近，其他杂质与主峰及各杂质之间分离均较好，故耐用性试验中主要考察依达拉奉与杂质P3之间的分离度。结果本品有关物质检测方法中流速、柱温、流动相pH、流动相B比例及检测波长等因素发生一定程度变化时，本方法均能满足试验要求，耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取3批样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行有关物质检测，结果见表4。可见，依达拉奉注射液中总杂质含量均不大于0.3%。

表4 依达拉奉注射液有关物质测定结果（%，n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长选择

通过对主药依达拉奉和各已知杂质（双吡唑啉酮、三聚体、杂质P1和杂质P3）分别进行紫外扫描，结果发现，各成分在245 nm波长处吸收率接近；且样品破坏性试验结果表明245 nm波长处降解杂质的检出率略高于240 nm波长处的检出率，故以245 nm作为依达拉奉注射液有关物质的检测波长。

3.2 分析方法比较

取本品及原研制剂分别按自研方法及日本药局方[16]收录的依达拉奉有关物质检测方法进行测定，对比考察不同方法下有关物质的检测情况，结果表明，自研方法中的杂质检出量较日本药典多，且各杂质间的分离度均较好；日本药典收载的检测方法没有明确检测的目标杂质，且色谱条件不能完全重现已知杂质的相对保留时间；且苯肼作为合成本品的起始物料，其最大吸收波长（224 nm）与其他已知杂质及主药的最大吸收波长（240～245 nm）相差较大，在同一色谱条件下不能检测出苯肼的真实量，因此单独建立方法测定苯肼含量。