姜 燕，戴丽娜

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006）

肿痛安胶囊由三七、天麻、僵蚕、白附子（制）、防风、羌活、天南星（制）、白芷8味中药组方，有祛风化痰、行瘀散结、消肿定痛功效，临床用于治疗风痰瘀阻引起的牙痛、咽喉肿痛、口腔溃疡、痹病（症见关节肿胀疼痛、筋脉拘挛、屈伸不利），以及破伤风的辅助治疗。现行质量标准仅有对三七中人参皂苷Rg1的含量测定，而无其他有效成分的定量分析[1]。中药复方制剂成分复杂，成分间相互干扰明显。为进一步控制肿痛安胶囊的质量，本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定制剂中三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BP211D型十万分之一电子天平（德国 Sartorius公司）；超纯水仪（美国 Milli-Q公司）；KQ-500TDB型高频数控超声波清洗器(上海星尧科学仪器有限公司)。

1.2 试药

三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110745-201820， 110703-201832， 110704-201726，纯度分别为 93.1% ，92.4% ，91.1%)；肿痛安胶囊（河北奥星集团药业有限公司，批号分别为161044，161103，161121）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相 A，水为流动相 B，按表 1 程序梯度洗脱；流速：1.0 mL／min；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样量：10 μL[2-5]。

表1 流动相梯度洗脱程序（%）

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取三七皂苷 R1对照品 26.20 mg，人参皂苷 Rg1对照品 20.04 mg，人参皂苷 Rb1对照品 20.10 mg，精密称定，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成混合对照品溶液，备用。取本品9 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率50 kHz）处理40 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按肿痛安胶囊的处方比例和生产工艺制备缺三七药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别精密量取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定(见图1)，结果3种成分与相邻色谱峰的分离度均不低于1.5。

专属性试验：取混合对照品溶液和阴性对照品溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图（见图1）。结果表明，阴性对照无干扰。

线性关系考察：分别精密移取混合对照品适量，用甲醇稀释，配制成三七皂苷R1质量浓度分别为487.80，243.90，122.00，60.98，15.25 μg ／mL，人参皂苷 Rg1质量浓度为 370.30，185.20，92.58，46.29，11.57 μg ／mL，人参皂苷 Rb1质量浓度为分别 366.20，183.10，91.56，45.78，11.44 μg／mL 的系列混合对照品溶液；进样测定，以峰面积比值（Y）为纵坐标、待测成分质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，回归方程及线性范围见表2。

表2 回归方程和线性范围(n＝5)

精密度试验：精密量取混合对照品溶液适量，制成三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1质量浓度分别为 97.59，74.07，219.73 μg ／mL 的混合对照品溶液，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，测定。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积积分值的 RSD 分别为 0.92%，0.88%，0.86%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：室温下取供试品（批号为161044）溶液，24 h内每隔2 h进样考察。结果三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1峰面积积分值的 RSD分别为1.88% ，2.16% ，1.92% （n ＝ 13），表明室温下供试品溶液放置24 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为161044）6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1平均含量分别为 276.9，530.6，617.4 μg／g，RSD 分别为 1.76% ，1.96% ，2.08% （n ＝ 6），表明本方法重复性好。

加样回收试验：取样品（批号为 161044）约 4.5 g，精密称定，共6份，分别精密加入各对照品溶液适量，依法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表 3。

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，测定含量。结果见表4。

3 讨论

3.1 检测波长选择

三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1均为皂苷类，理化性质相似，也有相似的色谱行为。2015年版《中国药典（一部）》三七中这

表3 加样回收试验结果（n＝6）

注：A为三七皂苷R1，B为人参皂苷Rg1，C为人参皂苷Rb1。3种成分的检测波长均为203 nm[2，6-10]。本试验中，在200～400 nm波长范围内对3种对照品进行扫描，结果3种对照品均有较好吸收，故最终确定检测波长为203nm。

表4 样品含量测定结果（n＝6）

3.2 流动相选择

本试验中对甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液4种流动相系统[11-15]进行了考察，结果显示，人参皂苷Rb1色谱峰保留时间较长，为缩短检测时间，故采用梯度洗脱。比较发现，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时，各色谱峰分离度达到要求，基线平稳，各成分分离较好且峰形明显，故被选择。

3.3 提取溶剂和提取方法选择

分别以甲醇、50%甲醇作为提取溶剂，采用超声（15，40，60 min）、加热回流（15，40，60 min）提取，结果显示，以甲醇作为提取溶剂、超声40 min的提取方法最简便，提取完全，且待测成分峰峰形较好。

综上所述，采用本研究中建立的HPLC法可同时测定肿痛安胶囊中3种皂苷成分的含量，该方法简便快速，重复性好，专属性强，可用于肿痛安胶囊的质量控制。