徐 悦，郑永强，付蓓蓓

（湖北省十堰市人民医院·湖北医药学院附属人民医院神经内科，湖北 十堰 442000）

脑缺血再灌注会导致局部缺血脑组织功能损害，其损害程度与缺血时间长短及残存血流量有关，短期不完全性缺血引起可逆性损害，而长期完全缺血或严重缺血会引起梗死[1-3]。内质网是细胞表面和细胞外蛋白质的合成、加工和转运的主要场所，当未折叠蛋白聚集及Ca2+平衡紊乱时，将发生内质网应激，进而诱导神经细胞凋亡[4-5]。自噬基因 Beclin1，Parkin，PINK1 是细胞凋亡调节因子[6]。复方脑肽节苷脂具有抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝等多种作用，能通过抑制缺血区苯二氮 受体的表达，减少半暗区面积，从而发挥对缺血脑组织的保护作用[7]。本研究中探讨了复方脑肽节苷脂对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用及对Beclin1，Parkin和PINK1表达的影响，为脑缺血再灌注损伤的临床治疗提供了理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试药

动物：清洁级 SD大鼠 120只，12周龄，体质量（109.76 ± 11.03）g，雌雄兼半，由山东大学医学院实验动物中心提供[动物生产许可证号SCXK(鲁)20090001]，大鼠自由摄食及饮水，自动控制昼夜循环（12 ／12 h），室温（22 ±1）℃。每周称体质量 1 次，每周调换笼位1次，符合《实验动物管理条例》要求。

仪器：MK3型酶标仪（美国热电公司）；ABI7500型荧光聚合酶链反应（PCR）仪（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）。

试药：复方脑肽节苷脂注射液（吉林步长制药有限公司，国药准字 H22026472，规格为每支2 mL）；银杏叶提取物注射液（金纳多，台湾济生化学制药厂股份有限公司，规格为每支 5 mL ∶17.5 mg）；Beclin1，Parkin，PINK1酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒(批号为KIT10154-2，KIT10416-7，KIT10575-1)，均购自南京金益柏生物科技有限公司；Beclin1，Parkin，PINK1一抗、二抗均购自武汉伊艾博科技有限公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；miRNeasy Mini试剂盒购自美国Qiagen公司；水为蒸馏水。

1.2 方法

建模与分组、给药：将120只SD大鼠随机分为6组，即假手术组（A组，等体积0.9%氯化钠注射液），模型组（B组，等体积0.9%氯化钠注射液），金纳多组（C组，50 mg ／kg）与复方脑肽节苷脂低、中、高剂量组（D1，D2，D3，2，4，8 mg ／kg）。B 组、C 组、D1组、D2组、D3组大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，结扎颈外动脉远端，在颈外动脉上切开1个小口，将1条尼龙线（直径0.25 mm，尖端涂抹硅胶）插入颈内动脉至20 mm，并结扎，4 h后，将线栓轻轻拉出，以建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。A组只切开皮肤和分离血管，不进行阻塞血流。术后给予大鼠20万U青霉素肌肉注射，连续使用3 d。建模成功后各组大鼠腹腔注射相应药物，每天1次，持续14 d，根据成人剂量公式相应换算，大鼠用药量为成人的6.24倍，将注射液溶于蒸馏水，以20.0 mL／kg剂量腹腔注射，配制药液质量浓度为10.0 g／mL。

神经功能缺损评分：分别于给药7，14 d时，根据Bederson JB评分法[8]进行神经功能缺损评分，包括运动、感觉、反射和平衡能力测试等。

贴纸去除及平衡木行走试验：给药14 d时，依据相关文献[9]方法进行。

Beclin1，Parkin，PINK1 mRNA 水平检测：给药 14 d后，处死大鼠，以逆转录定量聚合酶链反应（PCR）检测Beclin1，Parkin，PINK1 mRNA的表达水平。大鼠脑组织样品中提取总RNA，合成cDNA，以 β-actin引物为内参。PCR条件：95℃持续 10 min，40个循环，持续 15 s，温度 60 ℃ 。使用 SDS 2.0.1 软件（Applied Biosystems）计算循环阈值（Ct）值。

Beclin1，Parkin，PINK1蛋白水平检测：称取大鼠缺血脑组织，制成匀浆，收集上清液，以ELISA法检测Beclin1，Parkin，PINK1 蛋白水平。

Beclin1，Parkin，PINK1蛋白表达水平观察：制作常规大鼠缺血脑组织石蜡切片，使用常规链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法进行免疫组化染色，将组织列切片用二甲苯脱蜡，通过梯度乙醇脱水浸入含有0.3%过氧化氢的甲醇中20 min，将切片浸入pH 6的柠檬酸盐缓冲液中，并在800 W微波炉中加热10 min进行实现抗原修复。以抗生物素蛋白／生物素结合阻断内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，1% 的 Beclin1，Parkin，PINK1抗体工作液(1∶200，V／V)4℃孵育过夜（加链霉菌抗生物素蛋白）。3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，苏木精复染后封片，以乙醇脱水，以二甲苯澄清。随机选择10个高倍（400倍）视野，按阳性细胞数量及着色强度进行计分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；同时计数；阳性细胞＞50%为（+++），26% ～50%为（++），6% ～25%为（+），≤5%为（-），（-）及（+）归为不表达或低表达，即为阴性，（++）及（+++）归为高表达，即为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计学软件分析。计量资料以 X±s表示，行 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经运动功能评分

结果见表1。与A组比较，B组大鼠神经功能缺损评分显著升高(P＜0.05)；与 B组比较，C组与 D1组、D2组、D3组大鼠给药7 d及14 d时神经功能缺损评分显著降低(P＜0.05)，且与复方脑肽节苷脂给药剂量呈负相关。

2.2 双侧贴纸去除时间和平衡木过杆时间

结果见表1。与A组比较，B组大鼠双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间均显著延长(P＜0.05)；与B组比较，C组与D1组、D2组、D3组双侧贴纸去除时间、平衡木过杆时间均显著缩短(P＜0.05)，且与复方脑肽节苷脂给药剂量呈负相关。

2.3 Beclin1 mRNA，Parkin mRNA，PINK1 mRNA 表达水平

结果见表1。与A组比较，B组大鼠脑组织Beclin1 mRNA和PINK1 mRNA表达水平均显著降低，Parkin mRNA表达水平显著升高；与B组比较，C组与D1组、D2组、D3组大鼠脑组织Beclin1和PINK1 mRNA表达水平均显著升高，Parkin mRNA水平显著降低（P＜0.05），且随着复方脑肽节苷脂给药剂量的增加，Beclin1和PINK1 mRNA表达水平逐渐升高，Parkin mRNA表达水平逐渐降低。

2.4 Beclin1，Parkin，PINK1 蛋白表达水平

结果见表1和图1。与A组比较，B组大鼠脑组织Beclin1和PINK1蛋白表达水平均显著降低，Parkin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与B组比较，C组与D1组、D2组、D3组大鼠脑组织 Beclin1和 PINK1蛋白表达水平均显著升高，Parkin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），且随着复方脑肽节苷脂给药剂量的增加，Beclin1和PINK1蛋白表达水平均逐渐升高，Parkin蛋白水平逐渐降低。Beclin1，Parkin，PINK1阳性表达为棕褐色，各组Beclin1，Parkin，PINK1阳性表达情况与各蛋白表达水平相符。

表1 各组大鼠观察指标比较（X±s，n＝20）

图1 复方脑肽节苷脂对模型大鼠自噬基因表达的影响(×400)

3 讨论

Parkin和PINK1是调节神经细胞凋亡的重要调控因子，PINK1是抑制细胞凋亡蛋白，Parkin是促细胞凋亡蛋白[10-11]。细胞中，当Parkin表达水平较高时，PINK1与Parkin通过磷酸二酯脱氢键形成同源二聚体PINK1／Parkin，促进细胞凋亡，PINK1表达水平较高时则通过氢键形成异源二聚体PINK1／Parkin，抑制细胞凋亡[12-14]。Beclin1是调节内质网应激效应介导的细胞凋亡的保护主要因素。Beclin1可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程[15]。

复方脑肽节苷脂能促进缺血脑组织的新陈代谢，参与缺血脑组织神经细胞生长、分化和再生过程，具有抗细胞凋亡作用。复方脑肽节苷脂可能通过降低核因子-κB（NF-κB）活性及调节其表达而起到抗凋亡作用[16]。此外，复方脑肽节苷脂可以增强过氧化物酶-6的表达，从而减少缺氧诱导的内质网应激效应和氧化应激反应，减少神经细胞凋亡，达到保护神经细胞的目的。本研究结果显示，复方脑肽节苷脂能明显改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经功能、感觉及运动功能，高剂量效果尤为明显；能促进脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织Beclin1及PINK1表达，抑制Parkin表达，进而抑制神经细胞凋亡。

综上所述，复方脑肽节苷脂对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用较好，能明显改善其神经功能、感觉及运动功能，其机制与复方脑肽节苷脂能促进Beclin1 mRNA，PINK1 mRNA及蛋白的表达，抑制Parkin mRNA及蛋白的表达，进而抑制神经细胞凋亡有关。