王小艳 俞丁丁

子痫前期在世界范围内的发病率为5%～10%，作为胎盘缺血性疾病，其病因复杂，严重影响患者妊娠结局[1]。目前，子痫前期的发病机制尚无定论，但子宫-胎盘血液循环障碍导致的胎盘缺血缺氧以及大量细胞因子被释放进入母体血液循环在该疾病发生、发展中的重要作用已得到国内外学者的公认[2]。研究发现Notch信号通路能够通过影响细胞增殖、分化和血管形成等活动起到调节胚胎发育的作用，其同源配体Jagged1与DLL4更是与胎盘血管形成和发育密切相关[3]。但目前将胎盘组织中Jagged1与DLL4表达水平联合检测应用于子痫前期患者的研究较少。本研究旨在探讨Notch信号通路配体Jagged1与DLL4在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其意义。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年5月至2017年3月在本院接受剖宫产术分娩的子痫前期孕妇73例，年龄21～38（29.3±4.2）岁，孕 1～3（1.8±0.6）次。所有患者均符合《妊娠期高血压疾病诊治指南》[4-5]中相关诊断标准，排除合并慢性高血压、糖尿病、甲状腺功能异常、其他重要脏器器质性病变者。根据病情，将73例孕妇分为中轻度子痫前期孕妇37例（轻度组）和重度子痫前期孕妇36例（重度组）。另选取同期正常妊娠且接受剖宫产术分娩的孕妇 35 例作为对照组，年龄 19～39（27.2±3.5）岁，孕 1～2（1.6±0.7）次。患者与对照组年龄、孕次比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 3组孕妇均在剖宫产胎盘娩出后，立即从胎盘母体面中央切取2块约1cm3大小的胎盘组织，注意避开梗死区与钙化区。1块胎盘组织保存于无菌冻存管中，放置于-80℃冰箱内保存；另1块胎盘组织固定于4℃40g/L多聚甲醛溶液中。

1.2.2 胎盘组织中Jagged1、DLL4表达定位 采用免疫组化SP法。取固定胎盘组织进行常规石蜡包埋，4μm切片，内源性过氧化物酶使用3%过氧化氢清除。分别加入稀释度为1∶50的Jagged1抗人一抗和DLL4抗人一抗（美国Santa Cruz公司），阴性对照以PBS代替一抗。操作步骤严格按照SP法说明书进行。使用病理图像分析系统进行观察并拍照。

1.2.3 胎盘组织中Jagged1、DLL4蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取无菌冻存管中胎盘组织剪碎，将预冷裂解液加入进行冰上匀浆裂解1h。4℃下14 000g离心5min，取上清液，测定蛋白浓度。取50μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，待分离后置于硝酸纤维素膜，分别加入小鼠抗人Jagged1抗体（1∶1 000）和小鼠抗人DLL4抗体（1∶800），4℃下孵育过夜。洗膜，加二抗，室温下孵育1h。采用ECL法显色，以GAPDH作为内参。灰度分析使用Bandscan 5.0软件包。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用 Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎盘组织中Jagged1、DLL4表达定位 在对照组（图 1a-b）、轻度组（图 1c-d）、重度组（图 1e-f）孕妇胎盘组织中，Jagged1主要表达于绒毛滋养层细胞和血管内皮细胞，DLL4主要表达于血管内皮细胞。

图1 胎盘组织中Jagged1、DLL4表达定位（a：对照组胎盘组织中Jagged1表达定位；b：对照组胎盘组织中DLL4表达定位；c：轻度组胎盘组织中Jagged1表达定位；d：轻度组胎盘组织中DLL4表达定位；e：重度组胎盘组织中Jagged1表达定位；f：重度组胎盘组织中DLL4表达定位；免疫组化SP法，×400）

2.2 3组孕妇胎盘组织中Jagged1、DLL4蛋白表达水平比较 3组孕妇胎盘组织中Jagged1、DLL4蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。对照组孕妇胎盘组织中Jagged1、DLL4蛋白表达水平均高于轻度组和重度组，轻度组孕妇胎盘组织中Jagged1、DLL4蛋白表达水平均高于重度组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

3 讨论

Notch信号通路是单次跨膜蛋白家族的一员[6]，在脊柱动物中广泛存在，并在胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡和血管形成中扮演重要角色[7]。由于其功能缺失会导致果蝇翅膀发生缺刻（Notchs），故得此命名。在哺乳动物中，该信号通路由同源受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch 4）、同源配体（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2）和CSL-DNA结合蛋白所组成。当相邻细胞相互激活该通路时，细胞Notch受体与配体相结合，并释放活化的Notch区域，该区域被转移至细胞核，与转录因子CSL结合后对DNA起到调控作用[8]。

表1 3组孕妇胎盘组织中Jagged1、DLL4蛋白表达水平比较

近年来，大量研究发现Notch家族蛋白在胎盘组织中的表达与胎盘形成密切相关，尤其是同源配体Jagged1与DLL4[9]。Jagged1在正常胎盘组织的血管内皮细胞和绒毛滋养层细胞中呈高表达，而DLL4则在正常胎盘组织的血管内皮细胞中呈高表达。Santa等[10]研究发现胎盘血管内皮细胞中的Jagged1能够促进血管出芽，与胎盘血循环过程密切相关。Grochowski等[11]研究发现，子痫前期孕妇胎盘组织中DLL4表达有所降低，推测DLL4具有抑制血管增生和促进血管成熟的作用，与Jagged1在血管形成方面具有一定拮抗作用，两者共同促进胎盘血管生成发育。

本研究中，使用免疫组化SP法对胎盘组织中Jagged1与DLL4表达进行定位，结果与Spinner等[12]研究一致，提示Jagged1、DLL4与胎盘血管发育有关。胎盘富含血管，新生的血管网是胎盘正常发育和宫内胎儿正常生长的基础。而子痫前期孕妇胎盘血管的形成和增殖被抑制，使胎盘局部血管网络发育受限，导致血管数量下降、发育不足，产生胎盘血管重塑，从而导致胎盘缺血缺氧[13]。Otti等[14]研究发现Jagged1与DLL4在正常妊娠胎盘组织中具有较高的相关性，并可能存在动态平衡，前者增加新生血管数量，而后者则抑制无功能血管的过度增殖，并使其功能成熟。而本研究发现，与对照组孕妇比较，轻度组和重度组孕妇胎盘组织中Jagged1与DLL4蛋白表达水平均有不同程度下降，提示子痫前期孕妇胎盘组织中存在Jagged1与DLL4表达失衡，而该失衡导致的新生血管发育不足可能与子痫前期的发生有密切联系。

综上所述，子痫前期患者胎盘组织中Notch信号通路配体Jagged1与DLL4表达失衡，与子痫前期的发生、发展有一定联系，但具体机制仍有待于进一步研究。两者联合检测有望为子痫前期的防治提供新的靶点。