何万领 李晓丽 杨肖娥

（1 河南科技大学动物科技学院 动物生物饲料与精准营养实验室 河南洛阳471023 2 环境修复与资源再生教育部重点实验室 浙江大学环境与资源学院 杭州310029）

缺铁是个世界性的营养失调问题，补充一定剂量的铁剂被认为是有效预防铁缺乏的重要措施[1]。然而，饮食中的某些成分可能在一定程度上抑制铁的吸收[2-3]。早期的研究发现，茶叶中的多酚类物质能与铁离子结合，并抑制铁的吸收[4-6]。然而，关于饮茶与铁吸收之间关系的研究结果，目前说法不一。部分研究通过直接添加多酚类或提取茶叶成分再添加的方式研究其对铁吸收的影响，均发现铁吸收受到显著抑制[7-8]。Kaltwasser[9]对遗传性血色病人的临床试验表明，进餐的同时饮茶可降低铁吸收，并增加体内贮存铁的消耗。而另一用SD 大鼠模型的研究表明，饮茶对铁吸收的影响作用并不明显[10]。笔者认为以上研究结果的差异可能与实验模型、铁形态、饮茶间隔以及饮茶时间等有关。目前，在微量元素生物有效性研究方面，最常用于代替人体的实验模型为SD 大鼠模型[11-12]和Caco-2 细胞模型[13-14]。本试验利用SD 大鼠模型联合Caco-2 细胞模型研究饮茶对硫酸亚铁、EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁3 种形态铁生物有效性的影响，以揭示饮茶与铁吸收的关系，从而为人们合理饮食，进而提高铁吸收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD 大鼠，河南科技大学医学院实验材料中心；Caco-2 细胞株，中国科学院上海细胞生物研究所；龙井茶叶，杭州英仕利生物科技有限公司；FeSO4·7H2O（分析纯）、EDTA-FeNa（分析纯）和柠檬酸亚铁（分析纯），美国Sigma 公司。试验中所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

全自动血细胞分析仪（XF9080A），南京浩海仪器仪表有限公司；电感耦合等离子体质谱仪（7500a），美 国Agilent 公 司；二 氧 化 碳 培 养 箱（B15），德国 Kendro Laboratory products GmbH公司；超净工作台（SJ-CJ-2FD），苏洁医疗器械有限公司；倒置显微镜（TE2000U），日本Nikon 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 SD 大鼠模型构建 试验选用84 只生长健康、体质量（60±1）g 的雌性SD 大鼠随机分成A，B，C，D，E，F，G 共7 组，每组3 个重复，每个重复4 只大鼠。其中A 组为对照组，饲喂不加铁的基础日粮，B，C，D 组分别在基础日粮的基础上添加40 mg/kg（以铁计）的硫酸亚铁，EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁，以上各组饮水为去离子水；E，F，G 组日粮组成分别与B，C，D 组相同，饮用水改为用去离子水泡制的龙井茶。

龙井茶配制：称取5 g 龙井茶叶，放入已冷却至80 ℃的去离子水中，浸泡10 min，过滤，取茶汤，冷却后置于4 ℃冰箱中保存备用（要求每次配制的茶汤在3 d 内用完，否则弃掉，按上述方法重新配制）。

各试验组大鼠均采用塑料筐饲养，上层为不锈钢网，饮水瓶为塑料质地，为防止铁的污染，凡SD 大鼠饲喂用具统一用稀盐酸过夜浸泡，以去除铁的污染。试验开始前，各组均饲喂不加铁的基础日粮，饮用去离子水1 周，随后，各组按照上述设计饲喂和饮水。试验期间管理条件相同，每周称重1 次，试验期为30 d。

1.3.2 体外消化/Caco-2 细胞模型构建

1） 细胞培养与模型建立 在25 cm2细胞培养瓶（美国Corning）中对Caco-2 细胞进行传代培养，试验所用培养基为DMEM 高糖混合培养基，其主要成分（含量）：胎牛血清（10%）、非必需氨基酸（1%）、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）和MEM（Minimum essential medium）基础培养液。细胞在37 ℃，5%二氧化碳和90%相对湿度的二氧化碳恒温培养箱中培养。每2～3 d 换新鲜培养液1 次，经过20～30 次的传代后用于吸收试验。

将在细胞培养瓶中生长至80%～90%融合的细胞接种于6 孔Transwell 细胞培养板的插入槽中（膜孔径0.4 μm，生长面积4.7 cm2），接种密度为105个/cm2。从而构建成Caco-2 细胞吸收模型。转运槽顶膜侧加入1.5 mL MEM 混合培养基，基底侧加入2.5 mL 混合培养基，第1 周每48 h 换液，一周之后每24 h 换液，细胞培养到21 d 后备用。用于吸收试验前先进行细胞单层形态学和生化分析，以确定是否可用于试验。

2） 细胞铁吸收试验设计 胃液、胰液配制以及硫酸亚铁、EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁的模拟胃、肠道消化步骤参考Glahn 等[13]的方法，最终获得铁消化液。

茶孵育对不同形态铁吸收影响的试验设计：用移液枪准确吸取新鲜的上述铁消化液1.0 mL，与一定体积MEM 培养基混合，配制成铁浓度为70 μmol/L（研究者早期的一些研究发现，高铁浓度易导致细胞毒性，为此在本实验中选用SD 大鼠日粮添加的1/10 量，并按照等比例原则设计茶汤的用量）的细胞培养液，准确吸取该系列培养液1.5 mL 加入培养板顶部，在培养板基底部加入2.5 mL 无血清的MEM，放入培养箱中继续培养22 h。

茶孵育时间对铁吸收影响的试验设计：选用70 μmol/L 的硫酸亚铁作为孵育液，分别在硫酸亚铁孵育后的0，5，10，20，30，45，60，90 min 添加龙井茶溶液，继续孵育22 h。

1.4 样品采集与指标测定

1.4.1 SD 大鼠样品采集和指标测定

1） 血液生理指标测定 动物试验结束后，心脏采血，迅速用全自动血细胞分析仪 （型号：XF9080A）测定红细胞总数（RBC）、红细胞压积（HCT）和血红蛋白浓度（Hb）。

2） 血清总铁含量的测定 在酸性溶液和还原剂的作用下，使运铁蛋白中的铁与蛋白分离，使血清中的高铁还原成亚铁。后者与双吡啶结合成粉红色的络合物。在一定范围内，铁离子的多少与色泽呈正比。计算公式：血清铁含量＝（R－B／S－B）×标准液质量浓度 （2 mg/L）。式中，R——测定管；B——空白管；S——标准管。

3） 血清总铁结合力的测定 在血清中加入已知量的铁标准液，使血清中全部的转运铁（Tf）与铁结合达到饱和状态，再用吸附剂（轻质碳酸镁）除去多余的铁。再按测定血清铁的方法测定铁的含量，其结果为总铁结合力，如再减去先测的血清铁，则为未饱和铁结合力（UIBC）。计算公式：总铁结合力＝（R－B／S－B）×标准液质量浓度（1 mg/L）×样本测试前的稀释倍数 （2）。式中，R——测定管；B——空白管；S——标准管。

4） 肝脏、 肾脏铁含量的测定 将大鼠肝脏、肾脏于烘箱内烘干至恒重，磨碎，准确称取0.01 g，置于50 mL 特福龙管中，用5 mL 移液枪准确吸取盐酸4.5 mL，混匀，静止过夜后，加入0.5 mL 双氧水，用微波消解仪消化，消化具体程序：60 ℃30 min，115～120 ℃2 h，125 ℃30 min，消化液置于50 mL 塑料瓶中，用去离子水定重25 g。用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定其铁的含量。

1.4.2 细胞样品的收集与测定 细胞试验结束后，吸出培养液，用D-Hank’s 液冲洗2 次，每次2 mL。将培养板放入超声波振荡器中破碎15 min，此过程在4 ℃冷室内进行。用2 mL 去离子水充分冲洗细胞入5 mL 塑料离心管中。取部分通过考马斯亮蓝法测定细胞蛋白质。取部分细胞混合液，用铁蛋白试剂盒测定细胞铁蛋白量。

1.5 统计分析

采用Excel 软件进行初步分析后，用SPASS13.0 版统计软件中的ANOVA 模块进行单因素方差分析，并用LSD 法多重比较，所有结果均用“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 饮茶对SD 大鼠铁生物有效性的影响

饮茶对补铁SD 大鼠血液红细胞数、红细胞压积、血红蛋白量的影响见表1。与对照组相比，补铁各组血红蛋白、 红细胞数和红细胞压积均有不同程度升高，其中补铁各组大鼠血红蛋白量显著高于对照组（P＜0.05）。饮茶后，大鼠红细胞数均不同程度低于对照组，其中柠檬酸亚铁组在饮茶后其红细胞数显著低于对照组（P＜0.05）。与各单纯补铁组相比，饮茶降低了补铁的效果，且对EDTA-FeNa（P＜0.05）和柠檬酸亚铁（P＜0.05）组的抑制效果最显著。饮茶虽降低了补铁大鼠红细胞压积和血红蛋白量，但均未达显著水平（P＞0.05）。

饮茶对SD 大鼠血清总铁结合力和血清总铁含量的影响见表2。结果表明，3 种铁化合物均在不同程度提高了大鼠的血清总铁结合力和血清总铁，尤其是EDTA-FeNa 组效果最好，其血清总铁结合力和血清总铁量分别较硫酸亚铁和柠檬酸亚铁组高16.04%，13.35%和5.35%，16.84%。饮茶各组血清总铁结合力和血清总铁含量均高于对照组，而与单纯补铁组相比，其影响效果不显著。

表1 饮茶对补铁雌性SD 大鼠血液RBC、HCT、Hb 的影响Table1 Effects of tea on RBC，HCT and Hb in blood of female SD rats fed with iron

表2 饮茶对补铁雌性SD 大鼠血清总铁结合力和血清总铁的影响Table2 Effects of tea on serum total iron binding capacity and serum total iron of female SD rats fed with iron

从表3结果可知，补铁各组大鼠肝脏和肾脏铁含量均高于对照组。硫酸亚铁、EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁组肝脏铁含量分别提高了71.12%（P＜0.05）、87.1%（P＜0.05）和48.87%（P＞0.05），肾脏铁含量分别提高4.75%（P＞0.05）、92.94%（P＜0.05）和10.2%（P＞0.05）。饮茶在不同程度上降低了补铁大鼠肝脏和肾脏中铁含量，硫酸亚铁、EDTA-FeNa和柠檬酸亚铁组分别降低了15.07%，20.25%，26.88%和18.49%，30.19%，24.77%，虽无显著性差异。

表3 饮茶对补铁雌性SD 大鼠肝脏和肾脏中铁含量的影响（mg/kg 鲜组织样）Table3 Effects of tea on iron content in liver and kidney of female SD rats fed with iron （mg/kg Fresh foundation）

2.2 茶孵育对Caco-2 细胞铁吸收的影响

Caco-2 细胞吸收试验表明，用龙井茶配制的铁孵育液其铁吸收均在不同程度上受到影响（见图1）。与对照组相比，硫酸亚铁、EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁组Caco-2 细胞铁蛋白合成量分别增加了78.57%（P＜0.05）、202.79%（P＜0.05）和146.08%（P＜0.05），而用茶孵育后，细胞铁蛋白量较相应铁组 减少了39.52%（P＜0.05）、29.73%（P＞0.05）和48.82%（P＜0.05）。

图2显示补铁后一定时间进行茶孵育细胞对铁生物有效性的影响。结果表明，补铁同时立即给予茶孵育，其细胞铁蛋白量为（20.11±0.95）ng/mg蛋白质，5，10，20，30，45，60，90 min 后给予茶水孵育，其铁蛋白量分别增加了0.47，3.6，6.03，12.1，12.78，13.94，13.68 ng/mg 蛋白质。由此可见，补铁同时饮茶会严重影响铁的生物有效性，尤其是补铁后30 min 内饮茶对铁生物有效性有明显降低作用，而补铁45 min 后再饮茶，对铁生物有效性影响不显著。

图1 茶孵育对Caco-2 细胞铁吸收的影响Fig.1 Effects of tea on iron unptake by Caco-2 cells

图2 补铁后不同间隔时间饮茶对铁生物有效性的影响Fig.2 Effects of drinking tea at different intervals after iron supplementation on iron bioavailability

3 结论与讨论

3.1 两种模型在铁生物有效性评价中的应用效果

人体干预实验是直接反映试验因子效果的最佳方法，然而，由于在伦理道德和具体实施上存在很大困难[15]，实际操作中多采用一些模型进行相关研究。大鼠模型是较早用于代替人体实验的模型[16]。Forbes 等[11]利用“大鼠血红素再生法”（Rat hemoglobin repletion bioassay）研究铁的生物有效性，并发现与人体实验达到显著相关。随后很长一段时间，研究者们利用该模型研究了铁对人体的生物有效性。然而，Lopez 等[12]研究发现，大鼠肠道内的植酸酶活性显著高于人体。这表明，采用大鼠模型研究铁吸收的影响试验，其可行性值得探讨[17]。而Caco-2 细胞来源于人的结肠癌细胞，经培养后可形成类似于人肠道细胞的形态学和生化学特征[18]。Glahn 等[13]利用Caco-2 细胞模型研究铁的生物有效性，发现其与人体实验显著相关。目前，利用Caco-2 细胞模型研究人体对铁的生物有效性得到了广泛认可[19，20]。本实验利用SD 大鼠模型和Caco-2 细胞模型研究几种形态铁的生物有效性及其影响因素，发现血清Hb、血清铁、肝脏和肾脏铁是较为敏感的铁生物有效性指标，其反映出的结果与Caco-2 细胞结果具有很强的相似性。这一结果表明，两种模型均可代替人体实验用于铁生物有效性研究，而大鼠模型尚需要进一步选择敏感的反应指标。

3.2 不同形态铁生物有效性分析

铁化合物种类不同，其生物有效性也存在差异。本实验利用大鼠模型和细胞模型研究结果均表明，不同形态铁生物有效性存在很大差异，其中EDTA-FeNa 的生物有效性最高，柠檬酸亚铁次之，这一结果和早期研究结果相似[21-22]。而关于不同形态铁化合物对铁生物有效性的影响机制目前并不十分清楚，大部分研究认为可能是不同形态铁化合物释放铁的效率以及对铁的保护机制不同所致[8，23]。一般水溶性好的铁化合物，其释放铁离子的效率较高，生物有效性也高。另有研究指出，水溶性强的铁化合物由于释放铁离子的速度过快，游离态的铁离子在没有被吸收之前，很容易被食物成分结合而降低其有效性[24]。也有研究认为，一些有机态或螯合态铁在吸收过程中缓慢解离，分离出的有机物可能具有促进铁吸收的作用[22]，或者不被解离而以完整形态被吸收。此外，本研究认为，EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁的生物有效性高于硫酸亚铁，可能由于硫酸亚铁更容易氧化成三价铁，EDTA 和柠檬酸对二价铁均有一定保护能力。而人体（动物）和细胞主要吸收二价铁，对三价铁的利用效率低[25]。

3.3 饮茶对铁生物有效性的影响

科学的饮茶被认为具有促进人体健康的作用，是由于茶叶中含有对生物体有益的生物活性成分，如茶多酚等[26]。然而，研究表明，茶多酚可与铁离子结合成稳定的络合物[27]，从而降低铁吸收[5，6，24]。Glahn 等[8]研究多酚类对铁吸收的影响表明，多酚类对铁吸收有较强的抑制作用，当多酚类/铁摩尔比为1∶1 时具有最大的抑制效果。Yun等[28]研究也表明，当试验中依次添加0，5，10，25，50，100，200 mg 单宁酸后，Caco-2 细胞铁蛋白合成量依次降低，单宁酸添加量为10 mg 时，已对铁吸收达到显著抑制。Samman 等[9]将绿茶提取物添加到食物中，发现食物中非血红素铁吸收被抑制。然而有些动物实验结果表明，饮茶对铁吸收影响不大。Kim 等[29]研究指出，适当饮茶对铁吸收并无不利影响。陈飞飞等[11]利用SD 大鼠研究也表明，补铁一定时间后再饮茶对铁吸收并无显著影响。本试验研究表明，当补铁与饮茶同时进行，硫酸亚铁、EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁的生物有效性受到不同程度的影响，其中，硫酸亚铁受影响最大，柠檬酸亚铁次之，EDTA-FeNa 受影响最小。采用SD大鼠模型，以Hb 血清铁、肝脏铁和肾脏铁作为衡量指标时，饮茶对铁吸收的抑制率为12%～31%；采用Caco-2 细胞模型，以铁蛋白形成量作为指标时，饮茶对铁吸收的抑制率为29%～49%。这一结果表明，饮茶对铁生物有效性有抑制作用；若在补铁45 min 后饮茶，铁生物有效性基本不受影响。综合本研究结果，SD 大鼠模型和Caco-2 细胞模型在评价铁生物有效性方面具有很好的一致性。饮茶能够抑制硫酸亚铁、EDTA-FeNa 和柠檬酸亚铁的生物有效性，抑制效果与铁形态相关。建议补铁人群，在补铁过程中尽量不饮茶，或补铁45 min 后，再饮茶。