耿丽娜,张璧珠,李宝亮

(河北北方学院附属第一医院检验科，河北张家口 075000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全球范围分布广泛，其中发展中国家感染率较高，据报道我国HBV携带率高达10%～20%[1]。HBV感染除了引起肝脏病变外，还可导致全身多器官疾病，其中肾小球肾炎较为常见。1971年，COMBES等[2]首次发现HBV感染与膜性肾病有关，掀起了国内外研究HBV感染与肾脏疾病关系的浪潮。直到1989年在我国召开的乙型肝炎病毒相关性肾炎座谈会上，正式将该病命名为乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)，是指由HBV直接或间接诱发的肾小球肾炎，经血清免疫学及肾活检免疫荧光所证实，并除外与肾脏疾病相关、病因明确的其他继发性肾小球肾炎(如狼疮性肾炎)的一种疾病[3]。我国HBV携带者中HBV-GN的发生率较高，约为6.8%～20%[4]。已有研究报道在狼疮肾炎中自身抗体具有一定的诊断价值[5-6]，并且另有研究发现在HBV-GN中自身抗体有一定的增高，但尚未有研究揭示自身抗体在HBV-GN中的诊断和预测价值。由于感染HBV的患者中HBV-GN发病率较高，目前可预测疾病的指标较少，所以本研究着眼于探索有助于预测HBV-GN发病的免疫学指标——自身抗体，为此病的早期诊断和预防提供有价值的信息。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入研究者为2015年8月至2017年7月于河北北方学院附属第一医院首次就诊患者，分组及入选标准如下。(1)HBV-GN组：23例，诊断标准依据1989年HBV-GN座谈会上制定的标准[3]。血清HBV抗原阳性；患肾小球肾炎，并排除狼疮性肾炎等继发性肾小球疾病；肾切片上找到HBV抗原。入组的所有患者临床症状和实验室诊断均未达到自身免疫病的诊断标准：首先患者病史无自身免疫病，其次患者均未表现出自身免疫病的临床症状，再次患者外周血免疫球蛋白、红细胞沉降率(ESR)和C-反应蛋白(CRP)结果均未表现出异常，但部分患者补体水平降低，可能与形成的免疫复合物有关。(2)HBV非GN组：25例，血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性，经病理切片检查和血清学检测已排除相关肾小球肾炎。(3)健康对照组25例，血清HBsAg阴性，无肾小球肾炎和其他相关自身免疫性疾病的体检健康者。HBV-GN组男19例、女4例；平均年龄25岁；经实验室检查所有患者血清HBsAg均为阳性，24 h尿蛋白均在3.5 g以上，且肾组织切片中乙肝抗原(HBsAg或HBcAg)阳性；病理类型显示其中膜性肾病17例，膜增生型肾小球肾炎5例，系膜增生型肾小球肾炎1例。HBV非GN组男19例、女6例，平均年龄为28岁;经实验室检查所有病例血清HBsAg均为阳性且24 h尿蛋白均低于3.5 g，肾组织切片乙肝抗原为阴性。健康组男18例、女7例，平均年龄为26岁;经实验室检查血清HBsAg均为阴性，24 h尿蛋白均低于3.5 g，肾组织切片乙肝抗原均为阴性。

本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者在研究开始前签署知情同意书。

1.2主要仪器 全自动间接免疫荧光操作/酶联免疫一体机：Sprinter XL；全自动免疫印迹仪：EUROBlotMaster Ⅱ-50；荧光显微镜：EUROStar Ⅲ Plus。

1.3方法 临床上检测自身抗体有多种方法，其中最重要和最常用的是间接免疫荧光法检测抗核抗体和免疫印迹法检测抗可溶性核抗原(ENA)抗体谱。采用间接免疫荧光法检测血清抗核抗体(ANA)，滴度>1∶100为阳性，具体操作步骤如下：(1)将血清样本稀释100倍，滴加25 μL稀释后样本至加样板，与载片覆有生物薄片的一面接触，室温温育30 min；(2)用PBS吐温缓冲液流水冲洗载片，立即将其浸入装有PBS吐温缓冲液的烧杯中浸泡至少5 min；(3)滴加20 μL FITC标记的抗人IgG至洁净的加样板，将浸泡后的载片盖在加样板上与抗人IgG接触，室温温育30 min；(4)重复步骤(2)；(5)滴加约10 μL封片介质至盖玻片，将浸泡后的载片盖在盖玻片上，显微镜下观察荧光模型。

免疫印迹法检测血清自身抗体谱，包括nRNP、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMA-M2等14种不同抗原的IgG类抗体。具体操作步骤如下：(1)将膜条放入温育槽内，加入1.5 mL样本缓冲液，在摇床上温育5 min后吸去温育槽中的液体；(2)在温育槽中加入1.5 mL稀释100倍的血清样本，在摇床上室温温育30 min；(3)吸去槽内液体，用1.5 mL清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 min；(4)在槽内加入1.5 mL酶结合物，摇床上室温温育30 min；(5)重复步骤(3)；(6)在槽中加入1.5 mL底物液，摇床上室温温育10 min；(7)吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次1 min；(8)将膜条放在结果判定模板中，风干后判断结果。

以上试剂均来自于德国欧蒙医学实验诊断有限公司，所有步骤均根据说明书严格执行。

2 结 果

2.1HBV-GN组、HBV非GN组及健康组间ANA和抗ENA抗体谱阳性率分析 检测HBV-GN组、HBV非GN组及健康组血清中ANA和抗ENA抗体谱，分别对3组间ANA和抗ENA抗体谱阳性率进行比较。结果显示，与HBV非GN组和健康组相比，HBV-GN组ANA以及抗ENA抗体谱阳性率均显著增高，差异有统计学意义(P<0.01)。其中HBV-GN组ANA和抗ENA抗体谱双阳性的样本为8例，HBV非GN组ANA和抗ENA抗体谱双阳性的样本为2例，见表1。

表1 3组ANA和抗ENA抗体谱阳性率分析[n(%)]

注：HBV-GN组与HBV非GN组比较，aP<0.01；HBV-GN组与健康组比较，bP<0.01

2.2ANA核型及抗ENA抗体谱分析 经过分析实验数据，本文发现HBV-GN组ANA核型主要为核颗粒型(47.8%)，其次为胞浆颗粒型(13.0%)，抗ENA抗体谱主要为Ro-52(17.5%)和AMA-M2(17.5%)；HBV非GN组ANA同样以核颗粒型为主(16%),见表2。

表3 HBV-GN和HBV非GN组ANA核型和抗ENA抗体谱阳性率分析[n(%)]

2.3HBV非GN组自身抗体阳性更易发生HBV-GN 为研究自身抗体与乙肝患者发生HBV-GN的关系，本文对HBV-非GN组进行了为期12个月的随访，结果发现7例自身抗体阳性患者中有5例发生了HBV-GN，而自身抗体阴性患者中无1例发生(图1，P=0.000)。

图1 HBV-GN发生率曲线

3 讨 论

多数肾小球肾炎是由免疫介导的炎症疾病，其中继发性肾炎最常见的是HBV-GN和系统性红斑狼疮肾炎。许多研究已发现系统性红斑狼疮的病理性自身抗体参与了狼疮肾炎的发病，且有助于疾病的诊断[5-6]，但目前尚未有研究报道自身抗体在HBV-GN的临床应用，笔者在本研究中首次探讨了自身抗体在乙型肝炎相关性肾炎中的预测和早期诊断价值。自身抗体现已广泛应用于多种自身免疫性疾病或自身免疫功能紊乱相关性疾病的临床诊断及预后判断[7-9]。CACOUB等[10]发现HBV感染人体细胞后可以诱发自身免疫反应，继而产生多种自身抗体，LEI等[11]发现慢性HBV感染患者ANA和ENA阳性率达65%，张晓红等[12]发现慢性乙肝患者血清ANA阳性率为16.7%，以上研究表明有相当一部分乙肝患者体内存在自身抗体，但有很少研究关注增高的自身抗体对乙肝患者的预后产生哪些影响。

本研究发现HBV-GN患者与HBV非GN患者相比，血清抗核抗体和抗ENA抗体谱阳性率显著增高，分别高达73.9%和43.5%，于是本文认为自身抗体是否与乙肝患者发生肾炎有关。肾脏可以通过多种机制成为自身抗体的受害者，自身抗体可损伤肾小球或肾组织特异性抗原，如膜性肾病[13]，抗肾小球基底膜肾炎[14]和IgA肾病[15]等。有研究发现[16]，免疫复合物可以改变肾脏基底膜的结构，激活补体的经典路径，加剧C3a和C5a等趋化因子的炎症过程，另外由于C5b-9复合物的细胞溶解作用，补体末端通路也会导致细胞损伤。以上研究表明增高的自身抗体可致肾脏损伤，引起一系列肾脏疾病。

本实验发现，有28%的乙肝非肾炎患者血清自身抗体阳性，本文认为可能这部分患者尚未发生HBV-GN或因其他某些原因尚未致病。为了证实乙肝患者发生HBV-GN是否与自身抗体有关，本文对25例乙肝非肾炎患者进行了为期1年的随访，发现7例自身抗体阳性的乙肝患者在1年内有5例发生了HBV-GN，并且自身抗体阴性的患者无1例发生HBV-GN。以上结果均表明自身抗体在HBV-GN的预测和早期诊断中可能具有重要的意义，故对自身抗体阳性的乙肝患者进行定期监测或提早干预，有利于预防乙肝患者HBV-GN的发生。另外2例自身抗体阳性的乙肝患者可能因随访时间较短或自身抗体转阴而未发生肾炎，笔者将对病例继续跟踪。

4 结 论

综合本次研究的结果，HBV-GN患者比HBV非GN患者自身抗体阳性率增高，且自身抗体阳性的乙肝患者比自身抗体阴性的乙肝患者更易发生HBV-GN，说明自身抗体在HBV-GN疾病中有一定的预测价值。对自身抗体阳性的乙肝患者进行早期干预，可能会减少 HBV-GN的发生，具体干预方法有待进一步研究。