林 静,梁权辉,朱嫦琳,李炜煊

(佛山市第一人民医院检验科，广东佛山 528000)

关于男性不育，世界卫生组织将其定义为夫妇同居1年以上且性生活期间未采取任何避孕措施，由男方因素所致的女性不孕[1]。影响男性不育的因素众多，诸如性功能正常与否、输精管是否畅通、精子优良程度均为引发该病症的因素，以最后一个因素最为常见[2-3]。现有研究指出，遗传缺陷为精子质量较差的重要诱因，而Y染色体微缺失在所有遗传因素中占有重要的地位[4]。随着以试管婴儿、卵泡浆内单精子注射技术为代表的辅助生殖技术日臻成熟，对于基因缺陷引起的男性不育不再是一个不可解决的问题[5]，所以围绕Y染色体微缺失展开的研究成为一个全新的热点议题。本次研究围绕无精及严重少精症患者Y染色体微缺失类型与不同分型下性激素水平差异予以分析，探讨Y染色体微缺失检测在辅助生殖及治疗中的运用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2017年1月至2018年5月收治的293例无精及严重少精症患者为研究对象，在患者知情同意下实施Y染色体AZF检测，依据检测结果分为Y染色体微缺失组21例及Y染色体无微缺失组293例。Y染色体微缺失组患者年龄23～45岁，平均(30.14±6.26)岁；病程时间1.5～5年，平均(2.34±0.16)年；病症类型：无精症5例、严重少精症16例。Y染色体无微缺失组患者年龄22～44岁，平均(29.20±5.24)岁；病程时间1.2～5年，平均(2.58±0.20)年；病症类型：无精症89例、严重少精症183例，均自愿参与本研究并签署知情同意书。纳入标准：(1)根据世界卫生组织发布的《男性实验室检测手册》，无精子症患者符合连续2次精液分析并离心后在沉淀中均未发现精子；严重少精子症患者符合连续2次精液分析结果为精子密度<5×106/mL；(2)染色体核型正常者。排除标准：(1)弱精子症、精子无力症、精子数正常性不育者；(2)生理性不育者；(3)其他病理原因导致的男性不育者。两组无精及严重少精症患者在年龄等一般资料上比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1Y染色体AZF检测方法 紫色EDTA抗凝管采集患者外周静脉血2 mL，操作流程：(1)提取外周血细胞基因组DNA。(2)实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂配制。(3)PCR扩增。检测方法PCR，采用荧光探针进行多重PCR扩增，具体检测缺失位点为：AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)，AZFc(sY254，sY255)，AZFa，AZFb，AZFc为3个独立的检测区域，对应5种缺失模式，分别为AZFa，AZFb，AZFc，AZF(b+c)，AZF(a+b+c)，试剂盒由上海透景生命科技有限公司提供，所有步骤均严格按照试剂盒内说明书要求进行。使用的仪器设备为Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪(Biolytic美国)，对4个通道荧光(FAM /VIC/ROX/Cy5)同时进行检测。

1.2.2性激素水平检测方法 黄色凝胶促凝管采集患者空腹静脉血4 mL并以3 000 r/min离心15 min，收集血清后以电化学发光法进行性激素水平的测定，仪器设备为德国西门子拜耳公司生产的ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪，各指标生物参考区间:FSH 1.00～7.00(IU/L)，LH 1.00～8.00(IU/L)，T 9.10～46.20(mmol/L)。

1.3观察指标 选取Y染色体微缺失位点和不同缺失模式以及性激素FSH、LH、T水平为观察指标。

2 结 果

2.1无精及严重少精症患者Y染色体微缺失位点和缺失模式构成 293例无精及严重少精症患者中Y染色体微缺失21例(7.17%)，缺失类型包括AZFc缺失12例(57.14%)、AZFa缺失2例(9.52%)、AZF(b+c)缺失4例(19.05%)、AZF(a+b+c)缺失3例(14.29%)，AZFc区缺失率最高，次之AZFb，AZFa最低，差异有统计学意义(χ2=16.645，P<0.05)。见表1。

2.2Y染色体微缺失与性激素的关系

2.2.1两组患者性激素水平比较 两组FSH、LH、T相比较，Y染色体微缺失组FSH高于Y染色体无微缺失组，差异有统计学意义(P<0.05)，LH、T差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 Y染色体微缺失位点和缺失模式例数及频率

表2 两组患者性激素水平比较

2.2.2Y染色体微缺失组内不同分型患者性激素水平比较 Y染色体微缺失组内不同分型患者性激素水平相比较，FSH和LH水平由高至低均依次为，AZF(a+b+c)缺失、AZF(b+c)缺失、AZFa缺失、AZFc缺失，AZF(a+b+c)缺失模式水平升高最为显著，差异有统计学意义(P<0.05)，T水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 Y染色体微缺失组内不同分型患者性激素 水平比较

3 讨 论

根据流行病学调查，目前全球范围内出现不育的育龄夫妇占比约为10%～15%，而在此其中约有半数是由男方因素所致[6-7]。既往临床认为核型异常、内分泌功能紊乱、长期接触环境毒物、生殖道病变、精索静脉曲张、睾丸等因素是导致男性不育的主要原因，但随着细胞遗传学以及分子生物学内容的不断拓展，位于Y染色体上的AZF基因日益引起医学界的重视与关注[8]。该基因一旦存在缺失情形，势必会给男性生育带来严重不利影响，引发无精或严重少精[9]。尽管当前研究已经一致证实Y染色体微缺失为男性不育的重要诱因，但是关于具体的缺失机制却并未形成一致共识，绝大多数学者认为Y染色体独特的单倍体结构是导致AZF缺失的主要原因[10]。理由如下：由于Y染色体为单倍体结构，自身不具有DNA修复能力，男性精子生成过程中胚细胞分裂尤为迅速，导致其与卵子结合时突变的风险更高，一旦某一个区域缺失就会给整个Y染色体带来不利影响[11]。故Y染色体微缺失检测能够帮助临床确诊无精或严重少精症患者的根本病因，目前已经在欧美发达国家中成为常规的不孕检测项目[12]。

AZFa、AZFb、AZFc为3个独立的检测区域，KRAUSZ等[13]研究表明AZFc区域的缺失率发生最高，其次是AZFb，AZFa的检出率最低，据此该学者指出男性不育患者Y染色体AZF区微缺失是导致其不育的主要原因且关系十分紧密。本次研究通过对293例无精及严重少精症患者Y染色体AZF进行检测，结果发现Y染色体微缺失21例(7.17%)，AZFc缺失12例(57.14%)、AZFa缺失2例(9.52%)、AZF(b+c)缺失4例(19.05%)、AZF(a+b+c)缺失3例(14.29%)，AZFc区缺失率最高，次之AZFb，AZFa最低，与现有研究成果基本吻合，均一致证实AZFc区域为Y染色体微缺失的主要类型以及热点缺失区域，但本文研究发现b位点单独缺失模式少见，常见联合a位点或者c位点出现联合缺失，其发生机制有待进一步研究。此外，本文研究证实，Y染色体微缺失组FSH显著高于Y染色体无微缺失组，差异有统计学意义(P<0.05)，而LH、T差异无统计学意义(P>0.05)，表明Y染色体微缺失将会导致患者生精能力下降，即便是生出的精子也并未发育成熟，使得下丘脑-垂体-性腺轴无法正常运转，能够抑制FSH的抑制素分泌严重不足，造成了FSH浓度的升高[14]。Y染色体微缺失组内不同分型的无精及严重少精症患者性激素水平相比较，AZF(a+b+c)缺失模式者FSH、LH水平显著高于其他缺失模式，差异有统计学意义(P<0.05)，T差异无统计学意义(P>0.05)，提示不同AZF缺失分型与性激素中FSH、LH存在着密切的关联性。AZFa区域的缺失者通常表现为支持细胞综合征(SCOS)，为绝对的无精子症，供精成为其唯一选择，AZFb区域缺失者表现为生精阻滞，精子生成被阻滞在精母细胞阶段，睾丸内几乎没有成熟精子形成，而AZFc区域缺失者尚存精子生成能力，但随着FSH的升高，精子数目呈进行性下降趋势，所以必须予以及早干预治疗或无创取精后冷冻保存[15]。

4 结 论

无精及严重少精症患者Y染色体微缺失位点以AZFc区域缺失为主、AZFb缺失次之、AZFa缺失少见；所形成的5种缺失模式中，又以AZFb单独缺失模式最为少见，常联合a位点或者c位点出现共同缺失。FSH水平在Y染色体微缺失患者中显著升高，其中AZF(a+b+c)缺失模式的FSH水平升高最为显著，通过检测Y染色体有无缺失可为辅助生殖及治疗提供强有力的帮助。