黄 琳，戴 玮，张传明，夏吉荣

(重庆医科大学附属第一医院检验科,重庆 400016)

1,3-β-D-葡聚糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)作为侵袭性真菌病(IFD)的快速实验室指标已在临床上广泛应用，从报道[1-7]显示，G试验和GM试验对IFD诊断的灵敏度分别在48.3%～92.0%和41.7%～95.0%，特异度分别在35.0%～88.9%和88.4%～97.0%之间，各家报道的差异较大，这是否与研究者选择的研究对象数量，或研究病例诊断方法有关有待进一步验证。文献[1-7]研究病例在30～500例之间，差异较大；同时诊断IFD多以临床诊断方式，而非无菌体液病原学真菌培养结果为“金标准”，或病理结果来确诊。因而G试验和GM试验诊断IFD相关性研究的难点在于临床确诊“金标准”的获得困难，为进一步探讨G试验和GM试验在IFD诊断中的临床价值，本文对本院2017年3月至2018年6月期间临床疑为IFD，同时送检G试验、GM试验和血培养患者的检测结果作相关性分析，发现G试验和GM试验与血培养真菌结果符合率分别为92.1%，86.2%；G试验和GM试验联合检测阴性结果与血培养真菌结果符合率高达99.0%，是排除侵袭性真菌感染的特异性指标，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 2017年3月至2018年6月间本院临床疑为IFD患者，其中同时送检G试验、GM试验和血培养的住院患者455例，男301例，女154例，平均年龄56.8岁；病例来自重症监护室、神经内科、神经外科、呼吸内科、血液科、干细胞移植中心、老年科、肾内科、感染科、肿瘤科等。根据中国侵袭性真菌感染工作组2017年“血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则(第五次修订版)”标准[8]：以患者病史、危险因素、可能感染的临床特征、影像学检查等作为疑似IFD患者同时送检G试验、GM试验和血培养。其中:(1)血培养真菌结果阳性，临床确诊为侵袭性真菌感染的49例(IFD组)，男30例，女19例，年龄15～88岁。(2)血培养真菌结果阴性，临床确诊为非侵袭性真菌感染的406例(非IFD组)，男271例，女135例，平均年龄57.4岁。

1.2仪器与试剂 G试验检测：MB-80微生物动态快速检测系统，Tol智能恒温仪GKT-10MSet动态真菌检测试剂盒和质控品，均由北京金山川科技发展公司提供。 GM试验检测：Sunrise酶标仪(重庆恩鸣医疗设备公司)，离心机，振荡器。检测试剂由美国Bio-Rad公司提供。真菌病原学检查：法国生物梅里埃3D血培养仪、Vitek2-Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统、全自动快速微生物质谱检测系统(MS)，美国BD公司BACTECTM FX型全自动细菌培养系统。

1.3方法

1.3.1检测标本 用一次性无菌、无热源真空采集管采集静脉血3 mL，进行3 000 r/min离心10～15 min，分离血清，2 h内完成检测。不能及时检测的标本放置2～8 ℃冷藏，但不超过24 h。

1.3.2G试验检测 (1)标本前处理：取离心血清0.1 mL，加入装有0.9 mL样品处理液中，混匀后70 ℃孵育10 min，取出立刻放入冷却槽冷却5 min，为待测血清样品。(2)用无热源的吸头取待测血清样品0.1 mL，加入至9 mm×65 mm无热平底试管中，再加入0.1 mL反应主剂溶液，混匀后插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应，反应结束后检测系统自动计算出待测血清中1,3-β-D-葡聚糖含量。

1.3.3GM试验检测 (1)标本预处理：在1.5 mL聚丙烯管中加入300 μL待测离心血清和对照血清，每个试管内加入100 μL样本处理液，混匀后用加热器在120 ℃的温度下加热6 min(或在100 ℃水浴下加热3 min)后取出再次放入离心机，离心10 min后取上清液。(2)将预处理后的待测样本加入GM抗体包被的微孔板孵育90 min后洗涤，加入四甲基联苯胺(TMB)底物显色，加终止液终止反应，用酶标仪在450 mm波长下测定样本与对照孔的OD值，通过换算公式将OD值转化为血清学指数，血清学指数=样本OD值/临界值血清OD值。

1.3.4真菌病原学检查 真菌血培养按《侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南》进行。

1.5G试验和GM试验阳性判断的标准 G试验结果以试剂盒说明书中1，3-β-D-葡聚糖≤60 pg/mL为阴性。 GM试验结果以试剂盒说明书中血清指数I>0.5为阳性；I≤0.5为阴性。

2 结 果

2.1IFD组、非IFD组的G试验和GM试验检测值水平 以血培养真菌结果为IFD确诊指标，将病例分为IFD组和非IFD组，G试验和GM试验的检测值水平见表1。

表1 IFD组和非IFD组G试验和GM试验 检测值水平

2.2G试验和GM试验诊断IFD的临床效能 以G试验和GM试验检测结果大于阳性判断值为IFD实验室指标，以血培养真菌阳性结果为IFD确诊指标。G试验、GM试验诊断IFD的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、约登指数性能指标，见表2。

表2 G试验、GM试验诊断IFD的性能效能(%)

注：*串联检测表示，两项试验均为阳性；并联检测表示，两项试验中任何一项试验阳性;a：与G试验比较差异有统计学意义，P<0.05；b：与GM试验差异有统计学意义,P<0.05；c:串联与并联试验差异有统计学意义

2.3不同浓度水平的G试验和GM试验对IFD诊断效能 将G试验在不同浓度水平下诊断IFD的效能作ROC曲线分析，G试验浓度在43.5 pg/mL时，灵敏度75.5%，特异度92.4%,诊断效能最高，SROC=0.859(95%置信区间78.9%～93.0%)。见图1。

图1 G试验诊断IFD的ROC曲线

将GM试验不同血清学指数用于诊断IFD作ROC曲线分析，GM试验血清学指数在0.49时，灵敏度和特异度分别为40.8%和93.6%,诊断效能最高，SROC=0.581(95%置信区间47.2%～68.9%)。见图2。

图2 GM试验诊断IFD的ROC曲线

图3 侵袭性真菌感染的菌株分布

2.4侵袭性真菌感染的菌株类别分布 血培养真菌阳性的49例IFD确诊病例中，经鉴定为热带念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、拟平滑念珠菌、隐球菌等，各类菌株分布见图3。

3 讨 论

本文表1显示，IFD组和非IFD组的G试验和GM试验检测结果差异有统计学意义(P<0.001)，G试验和GM试验结果的合理应用将为临床IFD的早期诊治提供重要依据。从本研究结果表2中显示，G试验和GM试验诊断IFD特异度均大于90.0%，串联检测(两项中任一项阴性)特异度可达99.0%，比单独使用G试验和GM试验诊断IFD有显著统计学意义(P<0.05)，说明G试验和GM试验阴性结果时可拟排除真菌感染，联合检测诊断效率更高。G试验单独用于IFD诊断的灵敏度为65.3%，与文献报道[9-13]的灵敏度偏低,这是否与其他研究未全部使用无菌体液真菌病原学来确诊IFD有关，这还需进一步探讨。如G试验和GM试验并联使用(两项中任一项阳性)可提高IFD诊断灵敏度至71.4%，而GM试验单独用于IFD诊断的灵敏度较低只有24.5%，这可能与GM试验主要用于侵袭性隐球菌、曲霉菌和青霉菌等感染有关[14 ]，本文血培养确诊为隐球菌的只有2例，表明GM试验单独作为血流侵袭性真菌感染的实验室指标效率较低。G试验和GM试验临床诊断界值的合理设置有助于提高诊断效能，经ROC曲线分析，G试验检测浓度在43.5 pg/mL时，诊断效能最高，灵敏度75.5%，特异度92.4%,SROC=0.859(95%置信区间78.9%～93.0%)；GM试验血清学指数为0.49时，诊断效能最高，灵敏度和特异度分别为40.8%和93.6%,SROC=0.581(95.0%置信区间47.2%～68.9%)。

从本文确诊的49例IFD血培养真菌阳性菌株分析(图3)，侵袭性真菌感染的菌株主要为热带念珠菌17例(34.7%)，白色念珠菌13例(26.5%)，近平滑念珠菌10例(20.4%)，光滑念珠菌5例(10.2%)，拟平滑念珠菌、隐球菌及其他共4例(2.0%、6.1%)，相关信息可为临床治疗提供参考。

G试验和GM试验临床应用时应注意假阳性和假阴性干扰，本文最后确认的41例G试验或GM试验假阳性中，有6例经血液透析；34例使用了头孢、碳青霉烯类药物或输注了血液制品，1例为铜绿假单胞菌血流感染。确认的24例G试验或GM试验假阴性中，有1例为隐球菌感染，17例使用了抗真菌药物，3例为近平滑念珠菌感染，剩余3例原因不明。此外IFD患者容易合并其他细菌感染，本研究中有14例合并血流细菌感染。国外文献[15]认为血流细菌感染组与无血流细菌感染组的G试验结果差异有统计学意义，而国内研究认为差异无统计学意义[16]。本文合并感染的病例中只有1例假阴性，因此，真菌合并细菌感染时，G试验与GM试验对侵袭性真菌病诊断效能是否有影响也值得进一步研究。

用血培养真菌结果作为IFD诊断的“金标准”研究G试验和GM试验的临床应用价值，降低了以临床诊断的不确定性带来的偏差，为G试验和GM试验的临床应用研究积累了更客观数据。但研究时应注意不确定血培养结果的负面干扰，本研究明确为干扰血培养真菌假阳性病例就有17例。排除干扰外还应注意局部深部组织器官真菌感染时，血培养可出现非阳性结果。正如在本研究收集资料时发现有7例通过病理组织检查确诊侵袭性肺真菌病，但多次血培养均为阴性，其中G试验和GM试验诊断IFD灵敏度分别为42.9%和57.1%，并联检测灵敏度为71.4%。可以看出G试验灵敏度较上述研究中[1-7]较低，可能与这7例中有3例为肺部隐球菌感染以及病检病例数量不足有关。因此G试验和GM试验对于局限深部真菌感染的诊断仍然有不确定性，仅仅依靠临床诊断不足以确定其真实诊断效能，还需要更多的病检结果或其他金标准来支撑,但因为本研究聚焦于血培养作为金标准故未将此类病例纳入。此外，本研究只将无菌体液聚焦到了血液，而胸腹水、脑脊液等其他无菌体液标本未纳入研究，以及血液真菌培养阳性率不理想等影响了确诊数据收集的量和完整性，今后研究应增加其他无菌体液标本真菌培养结果，以及病理诊断结果，为G试验和GM试验诊断IFD积累更多客观证据。

4 结 论

以血培养真菌结果作为IFD诊断的“金标准”来研究G试验与GM试验的临床应用价值，减少了因临床诊断IFD带来的不确定性。研究表明：G试验与GM试验是IFD早期诊断的重要实验室指标，联合检测可提高诊断IFD灵敏度和特异度；特别是阴性结果对排除侵袭性真菌病的意义更为重大，同时设置合适的临界值可以较好地提高诊断准确性。综上所述，对其合理应用、综合分析可有效提高IFD的诊治水平，推进早期诊断、早期治疗，减少误诊及漏诊。