马丽媛,李 超，王伟伟

(1.青岛大学医学部，山东青岛 266003;2.青岛大学附属医院产科，山东青岛 266003；3.临沂市中心医院产科，山东临沂 276400)

妊娠期糖尿病(GDM)是孕妇妊娠期常见代谢异常疾病，我国GDM患病率为3%～8%，高于同期国际水平[1]。GDM多发生于妊娠中后期，患者不仅妊娠期高血压、子痫前期、远期糖尿病患病风险升高，且易出现早产、巨大儿、新生儿呼吸窘迫症等新生儿疾病[2]，严重威胁母婴健康。GDM发病机制复杂，涉及炎症应答、代谢紊乱及免疫异常等机体内系统失衡，由于GDM与2型糖尿病具有遗传相似性，故遗传易感性也被认为是GDM发病的关键因素之一，并且得到诸多研究证实[3]。雌激素通过雌激素受体(ER)发挥多种生物学效应，可在妊娠中晚期对抗孕激素作用，从而降低脂肪、肌肉组织胰岛素敏感性，导致GDM发生[4]。本研究通过对雌激素受体β(ERβ)基因AluI、RsaI酶切位点基因多态性进行分析，探讨ERβ基因与GDM遗传易感性关系，以期为GDM早期预防、干预提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择青岛大学附属医院(下称本院)2017年1-12月首诊GDM患者115例作为GDM组，GDM诊断标准：孕妇空腹血糖≥5.1 mmol/L，口服75 g葡萄糖1 h≥10.0 mmol/L、2 h≥8.5 mmol/L，3项检测结果满足其中1项或以上则诊断为GDM[5]。平均(31.2±4.7)岁，平均孕周(38.3±1.2)周，产前体质量指数(BMI)为(24.7±3.1)kg/m2。另配对选取同期本院健康孕妇115例作为健康对照组，平均(31.9±4.2)岁，平均孕周(38.6±1.1)周，BMI(24.3±2.8)kg/m2。排除标准：(1)具有吸烟史、饮酒史；(2)孕前患有高血压、2型糖尿病，或甲状腺功能亢进或减退等疾病；(3)辅助生殖技术受孕；(4)孕前3个月内或孕期使用皮质类固醇类药物史。两组孕妇均为汉族人群，在年龄、孕周等一般资料比较中差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究医院伦理委员会支持，所有入组者均知晓本研究目的、过程及意义，签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集 孕妇空腹12 h于次日清晨取乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管、肝素抗凝管静脉血各5 mL，肝素抗凝血3 500 r/min离心5 min后用于空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)测定，EDTA-K2抗凝于-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.2生化指标测定 FBG于本院检验科采用日立7600全自动生化分析仪测定，FIN采用罗氏Cobas E602全自动电化学发光分析仪测定，均购买成品试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行检测，实验室湿度、温度均符合检测要求。稳态模式评估(HOMA-IR)指数=空腹血糖×空腹血胰岛素/22.5。

1.2.3待测基因位点PCR扩增 采用北京天根生化科技公司提供的全血DNA提取试剂盒进行总DNA提取，严格按照试剂盒说明书进行操作，分光光度仪260/280吸光度值在1.6～2.0之间为合格DNA标本。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成，参考相关文献序列如下[5]：RsaI上游5′-TCT TGC TTT CCC CAG GCT TT-3′，下游5′-ACC TGT CCA GAA CAA GAT CT-3′，AluI上游5′-GAC CTG CTG CTG GAG ATG CT-3′，下游5′-AAT GAG GGA CCA CAG CA-3′。以提取DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：DNA 1.0 μL(0.15 μg/μL)、上游及下游引物各5.0 μL、10×PCR反应缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL(10 mmoL/L)、Taq-DNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL)，余以双蒸水补足25 μL。循环参数设置：94 ℃预变性4 min，95 ℃ 30 s，62 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，共35个循环。扩增产物于-4 ℃保存。

1.2.4RFLP分析 取PCR扩增DNA产物10 μL、限制性内切酶各缓冲液1 μL在37 ℃水浴箱内酶切3 h。终止反应后以2%琼脂糖凝胶电泳分离30 min，溴化乙锭染色(0.5 μg/mL)，将酶切凝胶置于紫外凝胶成像仪成像判断基因型。RsaI酶切区分RR 基因型(片段长度为125、31 bp)、rr基因型(片段长度为156 bp)、Rr基因型(片段长度为156、125、31 bp)，AluI酶切区分AA基因型(片段长度为240、67 bp)、aa基因型(片段长度为307 bp)、Aa基因型(片段长度为307、240、67 bp)。

1.3统计学处理 所有数据均采用SPSS17.0软件统计包进行分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验；采用拟合优度皮尔森χ2检验对GDM组、对照组AluI、RsaI基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡进行检测；非条件Logistic回归分析基因多态性与GDM易感性关系，以比值比(OR)及95%可信区间(CI)进行描述风险度，并经民族、年龄、家族史、妊娠次数等变量校正。所有检测结果均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1基因型分布 GDM组与对照组AluI位点AA基因型、Aa基因型、aa基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，P>0.05。GDM组与对照组RsaI位点RR基因型、Rr基因型、rr基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，P>0.05。表明本研究选择对象基因型具有群体代表性。

2.2AluI、RsaI位点基因型易感性分析 GDM组AluI位点AA型基因、Aa基因型比例显著高于健康对照组，aa型基因显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；基因易感性分析显示，AA、Aa基因型孕妇会增加GDM患病相对风险度(OR：1.973，95%CI：1.306～2.391，P=0.012；OR：1.426，95%CI：1.112～1.685，P=0.023)，合并分析显示A等位基因GDM患病风险高于a等位基因(OR：1.755，95%CI：1.287～2.061，P=0.019)。见表1。RsaI位点RR、Rr、rr基因型在GDM组、健康对照组表达差异无统计学意义(P>0.05)，基因易感性分析显示该位点基因型与GDM患病无显著关系(P>0.05)。见表2。

表1 AluI位点基因型易感性分析[n(%)]

表2 RsaI位点基因型易感性分析[n(%)]

2.3不同基因型GDM患者生化指标比较 将GDM患者患者按照AluI位点不同基因型进行分组生化指标比较，AA+Aa基因型患者产前BMI、0 h血糖及HOMA-IR指数显著高于aa基因型患者，0 h胰岛素显著低于aa基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。RsaI位点与GDM无易感性，未做分析。

表3 不同基因型GDM患者生化指标比较

3 讨 论

GDM是一种妊娠期女性首次被检测出糖耐量或糖代谢异常疾病，多发于妊娠中晚期，虽然多数GDM患者在产后可恢复正常糖代谢，但是在妊娠过程中其仍然是孕妇、新生婴儿相关疾病主要危险因素之一。GDM不仅会增加孕妇妊娠意外概率，还可因为长期高浓度血糖导致抗感染能力下降而发生生殖系统感染，此外GDM还可导致分娩结果改变、早产、巨大婴儿及孕妇远期糖尿病等，危及产妇及新生儿安全[1-2]。雌激素是女性内分泌系统中重要激素之一，在妊娠早期生理浓度的雌激素可通过上调胰岛素受体表达来增加脂肪、肌肉组织胰岛素敏感度[6]，但是当孕周增加至中晚期妊娠时体内雌激素浓度增加，相对高浓度雌激素会通过影响胰岛素受体表达及对抗孕激素作用，导致机体血糖利用能力下降，出现妊娠期糖尿病[7]。介导雌激素生物学效应的主要是ERα和ERβ，有研究显示控制这两种受体表达的基因会由于等位基因多态性而影响其表达及生物学功能，导致多种疾病发生[5,8]。基因多态性是一种较为常见的生理现象，随着分子生物学技术的发展，这一领域也得到更为深入的研究，目前认为其与多种疾病遗传易感性相关[9]。本课题组前期研究发现ERα基因PvuⅡ、XbaⅠ酶切位点多态性与GDM相关[10]，但是ERβ基因多态性与GDM有无遗传易感性目前还尚未见报道。

ERβ基因位于染色体14q23.2，有两种常见基因多态性位点，RsaI位点：在ERβ基因5号外显子配体结合区的1 082号核苷酸由于点突变会出现RsaI内切酶特异性识别位点；AluI位点：ERβ基因8号外显子3，端非编码区的1 730号核苷酸发生点突变出现AluI内切酶特异性识别位点[11]。ERβ基因RsaI位点、AluI位点多态性被证实与多种临床疾病相关。SHOUKRY等[12]对200例绝经后女性骨质疏松患者RsaI位点进行多态性分析，发现R基因可能与绝经后女性骨质疏松症易感性相关，而另一等位基因r则是该病的保护因素。基于雌激素及雌激素受体在孕期中的动态变化，ERβ基因多态性也是妊娠相关疾病研究热点。DOMNGUEZ等[13]在围生期抑郁发病危险因素研究中发现AluI位点A等位基因呈差异性，风险分析显示A等位基因是围生期抑郁高危因素。殷艳等[14]的一项流行病学调查发现，AluI位点A基因是维吾尔族妇女妊娠期胆内胆汁淤积症风险因素，而RsaI位点R等位基因是其保护因素。

本研究对GDM患者ERβ基因多态性进行分析，GDM组与对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律，提示选择对象具有群体代表性。研究结果显示GDM组AluI位点基因型与对照组相比差异有统计学意义，AA、Aa基因型孕妇会增加GDM患病风险，A等位基因可能是GDM易感性基因。RsaI位点各基因型在GDM组、对照组差异无统计学意义，亦与GDM无易感相关性。GDM主要表现为血糖、胰岛素异常及胰岛素抵抗现象，且雌激素受体在孕期中与糖代谢密切相关，本研究选择与GDM具有易感相关性的AluI位点基因进行相关指标分析，结果显示，AA+Aa基因型患者血糖、胰岛素抵抗高于aa基因型，而胰岛素低于aa基因型，与该位点基因型在GDM、健康人群中分布结果相符。本研究推测a等位基因调控的相关蛋白可能在雌激素信号传递过程中发挥关键作用，通过影响信号传导来调控终端胰岛素敏感性[15]，该基因型可能具有更高效胰岛素利用功能。

4 结 论

通过本次研究发现，ERβ基因AluI位点多态性可能与GDM易感性相关，A等位基因具有高GDM患病风险，且A等位基因患者糖代谢异常更为严重。本研究成果丰富了GDM的遗传因素相关理论，为GDM预防和后期干预提供新的依据。但是本研究还存在一定局限性，如样本例数较少、非多中心研究等，还需加强后续研究，以期进一步明晰GDM遗传易感性机制。