ELISA法与免疫膜条法检测抗MDA5抗体、抗TIF1γ抗体的比对分析

2019-05-17李柳冰刘晨曦张艳芳程琳琳晏颂欣李永哲

国际检验医学杂志 2019年9期

李柳冰，刘晨曦，张艳芳,2，程琳琳，晏颂欣，李永哲△

(1.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730；2.吉林大学第一医院检验科，吉林长春 130021)

皮肌炎(DM)是以对称性四肢近端肌无力为特征表现的异质性疾病，女性患者居多[1]。肌炎特异度自身抗体(MSAs)与疾病临床分型、临床特征相关，可有效辅助皮肌炎的诊断和预后评估[2-4]。免疫膜条法能有效快速地进行多个自身抗体的检测，在临床检测中的应用越发广泛。然而，有研究指出[5]，采用免疫膜条法检测自身抗体，会出现以下情况：(1)多个自身抗体出现假阳性；(2)免疫膜条法对自身抗体(如抗Jo-1抗体)的检测结果与其他方法(如免疫沉淀法)得到的检测结果存在较大不一致情况。基于此，本文分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和免疫膜条法检测皮肌炎患者血清中的两种MSAs：抗黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)抗体和抗转录中介因子 1γ(TIF1γ)抗体，探讨这两种方法检测抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体结果的差异性。

1 资料与方法

1.1一般资料本研究纳入的180例皮肌炎患者，来源于北京协和医院和卫生行业科研专项资助下的多家医院。其中男59例，女121例，年龄2～76岁，平均(43.40±18.64)岁。皮肌炎中包括经典皮肌炎(CDM)100例，无肌病性皮肌炎(CADM)11例，幼年型皮肌炎(JDM)29例，皮肌炎合并恶性肿瘤(CAM)40例。CDM和JDM患者均符合1975年Bohan/Peter诊断标准[6-7]，且JDM的发病年龄<18岁。CADM患者符合Sontheimer诊断标准[8]。CAM患者中对于恶性肿瘤的诊断均符合相应临床诊断标准。同时，排除合并其他自身免疫性疾病的皮肌炎患者。本研究已获得北京协和医院伦理委员会批准。

1.2仪器和试剂日本MBL公司抗MDA5抗体(批号：7873)和抗TIF1γ抗体(批号：7853)ELISA检测试剂盒；TECAN酶联免疫检测仪；德国欧蒙公司抗肌炎抗体谱IgG检测试剂盒(批号：DL1530-1601-4G)；欧蒙印记法自动操作仪；EUROLineScan欧蒙印迹法判读软件。

1.3方法本研究采用的抗MDA5抗体ELISA试剂盒、抗TIF1γ抗体ELISA试剂盒及抗肌炎抗体谱IgG检测试剂盒分别是同批号试剂。血清标本于-80 ℃低温保存并避免了反复冻融。实验过程中严格按照试剂说明书进行操作并对实验条件、检测仪器、实验人员等因素进行严格质量控制。

1.3.1ELISA法按照抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体ELISA检测试剂盒说明书要求，用样本稀释液101倍稀释血清样本。在相应微孔中分别加入100 μL标准品1、标准品2、阳性对照、阴性对照和稀释过的血清样本。室温(20 ℃～30 ℃)温育30 min，洗板4次，加入100 μL酶结合物，温育30 min，洗板4次后加入100 μL底物，温育15 min后加入100 μL终止液。于TECAN酶联免疫检测仪波长在450 nm处检测各孔吸光度值。待测样本的浓度值(U/mL)=(待测样品吸光度值-标准品1吸光度值)/(标准品2吸光度值-标准品1吸光度值)×100。样本浓度>32 U/mL为阳性。

1.3.2免疫膜条法抗肌炎抗体谱IgG检测试剂盒包含抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体。将检测膜条放入温育槽中，并在每槽中加入1.5 mL样本缓冲液，摇床温育5 min。吸去缓冲液，在每槽中加入1.5 mL 经101倍稀释血清样本。摇床温育30 min后，清洗3次，每次5 min。随后，在每槽中加入1.5 mL酶结合物，摇床温育30 min后清洗3次。再在每槽中加入1.5 mL底物，摇床温育10 min后，吸去液体，蒸馏水清洗3次。于欧盟印迹法自动操作仪(EUROBlotMaster)检测结果。着色强度>15为阳性。

1.4统计学处理采用SPSS20.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。同时进行Kappa一致性分析，以P<0.01认为两种方法的一致性具有统计学意义。Kappa值≥0.75，为一致性好；Kappa值在0.40～<0.75，为一致性一般；Kappa值<0.40为一致性差。

2 结果

2.1ELISA法和免疫膜条法的检测结果如表1所示，抗MDA5抗体用ELISA法和免疫膜条法检测的阳性率分别为29.44%和27.78%，差异无统计学意义(P=0.726)。抗TIF1γ抗体用ELISA法和免疫膜条法检测的阳性率分别为28.33%和20.56%，差异无统计学意义(P=0.086)。

表1 两种方法检测抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体阳性率的比较

2.2ELISA法和免疫膜条法对抗MDA5抗体检测结果的符合情况如表2所示，180例样本中，ELISA法检测出53例抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者，其中有39例免疫膜条法检测结果与ELISA法相符，阳性符合率为73.58%(39/53)，阴性符合率为91.34%(116/127)。两种方法对于抗MDA5抗体检测结果的总符合率为86.11%(155/180)。Kappa一致性检验：Kappa值=0.660(P<0.001)，认为两种方法对抗MDA5抗体的检测结果的一致性有统计学意义，但一致性一般。

2.3ELISA法和免疫膜条法对抗TIF1γ抗体检测结果的符合情况如表3所示，180例样本中，ELISA法检测出51例抗TIF1γ抗体阳性皮肌炎患者，其中有32例免疫膜条法检测结果与ELISA法相符，阳性符合率为62.75%(32/51)，阴性符合率为96.12%(124/129)。两种方法对于抗TIF1γ抗体检测结果的总符合率为86.67%(156/180)。Kappa一致性检验：Kappa值=0.642(P<0.001)，认为两种方法对抗TIF1γ抗体的检测结果的一致性有统计学意义，但一致性一般。

表2 两种方法对抗MDA5抗体检测结果的比较(n)

表3 两种方法对抗TIF1γ抗体检测结果的比较(n)

3 讨论

抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体均为皮肌炎特异度抗体，对皮肌炎的诊断具有重要意义。抗MDA5抗体最先于日本皮肌炎患者的血清中发现，该抗体阳性患者具有典型的皮肤受累如手掌丘疹、皮肤溃疡，且发生快速进展型肺间质病变的风险增加[9]。靶抗原MDA5是一种维甲酸诱导基因I样受体，参与抗病毒先天免疫防御，可识别出柯萨奇病毒、鼻病毒、登革热病毒和牛痘病毒等病毒类型[9]。LI等[10]对628例皮肌炎患者组与221例健康对照组进行meta分析，结果发现抗MDA5抗体与皮肌炎相关，尤其是与CADM密切相关。抗MDA5抗体对CADM诊断的合并灵敏度是62%(95%CI：52%～70%)，合并特异度是100%(95%CI：97%～100%)，综合受试者工作特征曲线下面积是0.94。抗TIF1γ抗体最早于2006年报道，在成年皮肌炎患者中的阳性率是20%～30%，在JDM患者中的阳性率为30%～40%[11-12]。靶抗原TIF1γ发挥转录调节、肿瘤抑制、DNA损伤修复等功能[13]。抗TIF1γ抗体与皮肌炎合并恶性肿瘤密切相关，抗TIF1γ抗体阳性患者中，超过50%患者会出现恶性肿瘤[3,14]。可见抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体是皮肌炎诊断和鉴别诊断不可忽视的辅助手段。

目前，检测皮肌炎自身抗体多采用ELISA法和免疫膜条法。免疫膜条法由于具有简便快速等优势，越来越多地应用于临床检测中。然而，文献报道指出，免疫膜条法存在一些弊端。HAMAGUCHI等比对免疫沉淀法和免疫膜条法对抗OJ抗体检测结果的差异性[15]。9例用免疫沉淀法证实有抗OJ抗体存在的血清，用免疫膜条法的检测结果均为阴性；52例用免疫沉淀法证实不存在抗OJ抗体的血清，用免疫膜条法的检测结果均为阴性。免疫膜条法对抗OJ抗体的灵敏度为0%，特异度为100%。CAVAZZANA等比对免疫沉淀法和免疫膜条法对抗Mi-2α、Mi-2β、TIF1γ、MDA5、NXP2、SAE、Ku、PM-Scl75、PM-Scl100、SRP、PL-7、PL-12、EJ、OJ、Jo-1抗体检测结果的一致性[5]。研究显示，两种方法对抗TIF1γ抗体、抗MDA5抗体和抗NXP2抗体检测的一致性好，对抗Mi-2α/β抗体和抗EJ抗体检测的一致性一般，对抗Jo-1抗体检测的一致性差。

前期，本研究采用的抗TIF1γ抗体ELISA试剂盒的检测结果与金标准免疫沉淀法进行了比对[16]，ELISA法的敏感度和特异度均为100%。本文采用ELISA法和免疫膜条法检测皮肌炎患者血清中的抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体，并对两种方法的检测结果进行比对分析，结果表明，ELISA法和免疫膜条法对抗MDA5抗体和抗TIF1γ抗体检测的一致性一般。本研究及前期研究结果显示，免疫膜条法与ELISA法、免疫沉淀法的检测符合度并不十分一致。可见，尽管这3组方法都能检测自身抗体，相对于操作要求不高，省时快捷的免疫膜条法，ELISA法和免疫沉淀法检测结果更准确。因此，当遇到免疫膜条法检测的自身抗体结果和患者临床特征不符的情况时，可采用ELISA法或免疫沉淀法对患者血清标本进行重新检测，从而确认检测结果，更好发挥自身抗体检测对临床的价值。

在本研究中，ELISA法和免疫膜条法结果不完全一致可能是由于免疫膜条法本身的缺陷所致，如膜条法上重组抗原纯度不够或者失效，导致免疫膜条法假阴性结果的出现；此外，也可能是由于实验环境因素(如温度)的影响。有研究指出[17]，免疫膜条法对温度敏感，尤其是对于弱阳性和阴性的标本，随着实验环境温度的升高，膜条的显色加深，从而导致假阳性结果的出现。基于此，当采用免疫膜条法进行实验时，应先评价该方法的准确性，探讨周围环境对实验结果的影响，从而保证检测结果的准确性。