陈欢，沈鉴东，谢佳孜，孙雪萍，崔毓桂，刘嘉茵，吴畏

(南京医科大学第一附属医院生殖医学科，南京 210029)

染色体结构异常的基础是染色体发生断裂及断裂后的异常重接。临床上较常见的染色体结构异常主要有：易位(相互易位，罗伯逊易位)、倒位、片段缺失(末端缺失、中间缺失)、片段插入、环状染色体、双着丝粒染色体、等臂染色体等。染色体倒位又细分为臂间倒位和臂内倒位。臂内倒位(paracentric inversion)某一染色体臂内发生二次断裂后，所形成的中间片段旋转180°重接，即形成臂内倒位。臂间倒位(pericentric inversion)一条染色的长臂和短臂各发生一次断裂后，形成的臂间倒位重接。世界上已报告的臂内倒位已有23种，臂间倒位24种[1]。其中，9号染色体的臂间倒位[inv(9)]较为多见，在人群中发生率为1%～3%，在亚洲人群中发生率最低约0.25%[2-4]。从遗传物质的得失角度看，这种结构变化没有导致遗传物质的丢失，因此具有倒位染色体的个体一般不具有临床表型，被称为携带者，被认为是与异常表型无关的染色体微小重排[4-6]。inv(9)一般被认为是染色体多态性，但研究发现inv(9)与不育、复发性流产等不良妊娠结局可能相关[2，7-17]或可能存在特发性生殖障碍[18]，inv(9)对妊娠结局的影响仍存在争议。复发性自然流产(RSA)是指与同一性伴侣连续遭受2次或2次以上在妊娠20周前的胎儿(体重≤500 g)丢失者，病因复杂，包括遗传因素、解剖异常、内分泌异常、感染因素、免疫紊乱和血栓前状态等，仍有接近半数的患者原因不明，临床上称为原因不明复发性流产(URSA)。已知的因素中50%～60%的早期自然流产是由于胚胎染色体异常所致[19-21]。因此，RSA是胚胎植入前遗传学筛查(Preimplantation genetic test for aneuploidies，PGT-A)的指征。对于inv(9)特别是合并流产史患者，是否需要行PGT-A仍然是困惑的问题[22]。本研究通过分析携带inv(9)的不孕症患者PGT-A胚胎检测及妊娠结局，为携带inv(9)的不孕症患者是否需要行(PGT-A)以及何种类型需要行PGT-A提供依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2007年9月至2018年6月在本中心接受PGT-A治疗的165对RSA夫妇的诊疗过程及妊娠结局。其中一方携带inv(9)的30对夫妇为A组；未携带inv(9)的135对夫妇为B组。所有这些患者均采用中心常规的PGT-A治疗流程。

二、研究方法

1.控制性促排卵：所有患者采用合适的方案促排卵。当主导卵泡直径达到18 mm左右给予HCG注射，36 h后行阴道超声介导下取卵术。根据患者情况选择新鲜周期或复苏周期移植。

2.受精、卵裂、胚胎移植情况：取卵术后第1日观察卵子受精情况，双原核(2PN)卵子作为正常受精卵。观察至D3或D5、D6行卵裂期胚胎(卵裂球活检)或囊胚期胚胎(滋养细胞活检)活检取样。

3.胚胎检测：使用荧光原位杂交(FISH)、微阵列-比较基因组杂交(aCGH)或二代测序技术(NGS)。选择检测为正常/平衡信号的胚胎移植。

4.妊娠结局随访：移植后2周测血清β-HCG；HCG阳性者停经50 d左右行阴道超声检查，观察宫腔内孕囊数目和胎心管搏动以确定临床妊娠，统计胚胎种植率和临床妊娠率等；停经70天再次超声检查确定胚胎发育情况；后期电话随访本周期妊娠结局，统计流产率和胎儿畸形率、性别、出生体重、妊娠孕周及有无先天畸形等情况。

三、统计学方法

结 果

一、患者基本情况比较

共纳入165例患者。其中inv(9)携带组(A组)30例，非inv(9)携带组(B组)135例。A组未移植与无可移植胚胎均为2例，B组未移植6例、无可移植胚胎25例。两组患者中无可移植胚胎者原因为卵母细胞质量差、未形成囊胚或胚胎检测染色体异常。

A组与B组间女方体重指数(BMI)、基础FSH、AMH水平相比较差异均无统计学意义(P>0.05)；B组患者的既往流产次数及女方平均年龄显著高于A组(P<0.05)(表1)。B组患者既往流产次数多于A组可能与其女方年龄大相关。

二、患者促排卵治疗实验室指标比较

两组间获卵数、受精率以及获胚数无统计学差异(P>0.05)；B组获卵数、平均移植胚胎数显著低于A组，而胚胎种植率显著高于A组(P<0.05)(表2)。A组患者获卵数高于B组可能与B组患者年龄偏大有关。

表1 患者的基本情况(±s)

注：与A组比较，*P<0.05

表2 患者的促排卵治疗实验室指标[(±s)，%]

注：与A组比较，*P<0.05

三、患者妊娠结局比较

一次取卵周期中，A组移植人数为26人，总移植周期为34周期，每移植周期临床妊娠率为58.8%，活产率为44.1%，每取卵周期累积妊娠率为76.9%，流产率为25.0%；B组移植人数为104人，总移植周期为125周期，每移植周期临床妊娠率为61.6%，活产率为51.2%，每取卵累积妊娠率为74.0%，流产率为16.9%。A组与B组的妊娠率、活产率及流产率的差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

四、胚胎检测结果比较

A组检测胚胎数209枚，结果异常胚胎130枚，胚胎染色体异常率为62.2%。其中通过NGS或array CGH进行胚胎检测有75枚，染色体异常率为46.6%，但异常染色体均非9号染色体。

B组活检胚胎数532枚，胚胎染色体异常率51.5%。

A组胚胎检测染色体异常率显著高于B组(P<0.05)(表4)。统计A、B组胚胎检测结果，≥3条染色体异常较多见，A组有4枚而B组有63枚，多倍体异常A组有1枚而B组有2枚，单一胚胎染色体异常分布情况见图1。A组1、2、7、13、15、16、18、21染色体异常率较高，但整体来看染色体异常分布无明显集中，而B组8、15、16、21、22号染色体异常概率较高。

表3 患者一次取卵周期妊娠结局(%)

注：累计妊娠率为累计至2018年6月一次取卵周期累计妊娠数/移植夫妇数

表4 患者胚胎检测结果统计(%)

注：嵌合体胚胎属于胚胎检测异常；与A组比较，*P<0.05

图1 两组胚胎检测结果分布统计

讨 论

关于inv(9)是否影响生育一直未有定论，部分学者认为从遗传学的角度看，某种变异的人群发生率>1%，即为正常多态性，9号染色体臂间倒位在各版的ISCN中都被列为染色体的正常多态性改变，其携带者由于遗传物质未有明显增减，故可能没有表型效应。但有一些学者认为inv(9)与其他倒位一样，虽然没有遗传物质丢失，但由于基因的排列顺序发生变化，倒位理论上可形成倒位圈，可能引起位置效应，从而影响配子、胚胎全染色体组拷贝数变化，从而引起流产、不孕不育等临床表现[2，7，13-15，23]。这些学者提出两种机制，一种认为倒位本身可能在减数分裂过程中妨碍配对的同源染色体；第二种机制就是染色体间存在的相互效应，认为inv(9)可以影响其他染色体配对，因为9号同源染色部分单体未配对而干扰其他的二价染色体配对分离[24-26]。

本研究中inv(9)携带者的胚胎检测结果中并未见与inv(9)相关的染色体变异，可能会有专家认为这一点本身就足以说明9号染色体臂间倒位与不良妊娠结局没有关联，但是考虑胚胎染色体异常率较单纯RSA患者高且具有统计学意义(所有病例已经针对复发性流产检查了目前可做的检查，未见异常或者有相关异常已做处理复查未见异常)。胚胎染色体异常一般与母亲年龄相关，而B组女方平均年龄大于A组。综上我们可以认为inv(9)可能通过干扰其他染色体二价体形成分离导致胚胎染色体异常率增加趋势，从而引起流产、胎儿畸形等临床表现。关于这种染色体间相互作用目前有两种假说，一是认为与两条9号染色体间异染色质长度差异相关，且有实验研究证明倒位至少需涉及染色体总长的30%才能产生重组染色体[25，27]，当涉及染色体总长的50%以上时，重组染色体风险明显增加，重组配子的频率与倒置染色体的比例直接相关[28-29]。另一种则认为与断裂位点的位置相关，认为若有一个断裂点位于G显带暗区，由于缺少同源性会发生异型联会[30]，或认为染色体有重组热点簇的存在，重组体的形成取决于特定区域中热点的存在和数量以及重组频率[31]。此外有的关于唐氏综合征家族的研究揭示了父母任一方inv(9)与子代唐氏综合征发生率的增加直接相关。分析倒位增加了染色体不分离的风险，与染色体间相互作用的假说相一致。有研究认为异染色质特别是9号染色体，在减数分裂期间影响近端着丝粒染色体(13、14、15、21、22、Y)分离[14，27，32-34]。但依据我们的研究inv(9)携带者胚胎染色体异常率较高，但其无明显分布特点，并未观察到端着丝粒染色体异常检出率增加。inv(9)的这种染色体间相互作用的机制尚不明确，需要分子水平上进行更多的研究，以了解染色体断裂点的重要性。且本研究样本数少，有待于扩大样本量进一步深入研究。但由于这种染色体间相互效应，推荐inv(9)携带且有多次流产史者可考虑PGT-A。

染色体臂内倒位携带者，减数分裂过程通过倒位圈产生4种类型配子，1种正常，其中1种倒位携带，其余2种含有部分重复和缺失的无着丝粒片段或双着丝粒染色体，使得半数配子的形成出现障碍，或出现半数畸形或无功能的配子，致使婚后多年不孕；同时，双着丝粒染色体和无着丝粒片段在有丝分裂中为不稳定性畸变，双着丝粒在合体的早期分裂中形成染色体桥，即使能怀孕，其后代在很早期即死亡[35]。纳入样本中仅有1例臂内倒位行PGT-A助孕，其胚胎检测染色体异常率高，但本研究中臂内倒位样本量太少，有待于扩大样本量进一步深入研究。

综上所述，inv(9)可能有增加其他染色体异常率的趋势，导致流产风险增加。对于inv(9)携带同时伴有多次流产史、不良孕产史者可考虑PGT-A助孕；而无反复流产史或不良孕史等，仅inv(9)携带的不孕患者，常规IVF/ICSI助孕即可。