王小萌，吴全娥

(1. 黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150036； 2. 河北中医学院基础医学院，石家庄 050200)

超过90%的脑卒中患者会出现偏瘫性侧肢体痉挛现象，主要表现为肌肉群的肌张力增高、协调出现异常[1]。目前，抗脑卒中恢复期痉挛的药物主要是改变中枢神经递质的含量和功能，虽然能改善肌肉痉挛的症状，但也会影响到正常的肌张力，而芍甘汤出自《伤寒论》，是酸甘化阴的方剂，在临床主要用于缓解肌肉痉挛等症状[2]。而木瓜根据《神农百草经》的记述“温能散湿，酸能滋肝、舒筋，故能治转筋血痹”。现代医学研究指出，木瓜和芍药具有协同作用，二者均有抗炎镇痛、护肝舒筋、参与机体免疫反应的作用。芍药可以收敛肝阴，木瓜辅之，酸收敛阴之力可以剧增，而如果独用木瓜则效果并不明显，而且木瓜有健脾化湿的功效，湿化则筋脉通畅，转筋则自除[3]。临床研究表明，芍甘木瓜汤可以被用来改善肠腓肌痉挛的症状[4]，但有关芍甘木瓜汤对脑卒中后肢体痉挛的作用还未见报道。因此，本文以在芍甘汤中加入木瓜，并辅以具有止痛、活血作用的川芎和川牛膝，配置成加味芍甘木瓜汤对脑卒中痉挛大鼠模型进行灌胃，研究其对痉挛大鼠模型肌张力和神经递质的影响，以期为芍甘木瓜汤在脑卒中痉挛患者康复中的应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 实验选用60只健康清洁级SD雄性、体质量(200±10) g的大鼠，由黑龙江省中医药大学提供。实验开始前7 d在饲舍内进行适应性饲养，温度为(22±2) ℃，每天8∶00～20∶00为光照时间，自由饮水和饮食。

1.1.2 药材 实验用药材饮片(白芍药、木瓜、甘草、川芎、川牛膝)由黑龙江省中医药大学提供，经50 ℃烘干、粉碎后过40目筛制成原粉。将白芍药、木瓜、甘草、川牛膝、川芎原粉按5∶3∶2∶2∶1的比例配成复方药粉后，以固液比1∶10加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取过滤后药汁混合，浓缩药汁使1 mL的药液相当于1 g的药粉，制成实验药液。

1.1.3 实验试剂 异硫氰酸荧光素、半胱氨酸购自美国Amresco公司，谷氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、γ-氨基丁酸、5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素标准品购自美国Sigma公司，正庚烷、冰乙酸、盐酸、邻苯二甲醛、高碘酸钠、四硼酸钠、亚硫酸钠购自天津化学试剂有限公司。

1.1.4 实验仪器 精密电子分析天平(瑞士赛多力斯仪器公司)、生理记录仪(美国BIOPAC公司)、高速低温离心机(美国Sigma公司)、高效毛细管电泳(美国Biorad公司)、荧光分光光度计(瑞士Tecan公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 脑卒中后痉挛模型的建立 根据刘鸿燕的方法建立大鼠内囊电损毁模型[5]。在预饲养第7天随机选择大鼠10只作为空白对照组，再随机选择大鼠10只作为假手术组，剩余40只大鼠用于建造内囊电损毁痉挛模型。将大鼠麻醉，头部剪毛固定，沿颅顶矢状缝纵行切口确定内囊位置，用电钻在颅板钻孔，将电极阳极垂直插入通直流电刺激，以毁损内囊，刺激后拔出电极，缝合皮下组织及皮肤。

1.2.2 设计和分组 实验采用单因素设计，大鼠根据实验处理不同被分为对照组、假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量物组每组各10只，以造模第1天为实验第1天，实验期28 d，在实验期内保持与预饲养期相同的饲养方式，具体处理方法如下：对照组选用未做任何处理的大鼠，每天按1.0 mL/100 g灌胃生理盐水；假手术组对正常大鼠做钻孔手术但不损毁内囊，每天按1.0 mL/100 g灌胃生理盐水；模型组每天按1.0 mL/100 g给造模大鼠灌胃生理盐水；低剂量组每天按0.5 mL/100 g给造模大鼠灌胃药液；中剂量组每天按1.0 mL/100 g给造模大鼠灌胃药液；高剂量组每天按1.5 mL/100 g给造模大鼠灌胃药液。

1.2.3 检测指标与方法 (1)伸直幅度测定：分别在造模后第1天给药治疗前和给药治疗的第25天采用多导生理记录仪测量大鼠痉挛肢体的伸直幅度。将电刺激针的一端插入被固定到刻度板大鼠的痉挛侧上肢胧三头肌内，另一端则插入大鼠的尾部，并在痉挛侧上肢下端系一根丝线，将丝线经传感器与生理记录仪连接，对胧三头肌定时进行2 mA的电刺激，记录实验大鼠上肢伸直的幅度(cm)。

(2)氨基酸类神经递质含量检测：在实验第28天将大鼠麻醉后处死取头部，在冰浴上迅速将大鼠的大脑和脊髓剥离，取内囊称重后放入到预冷组织匀浆器中，按固液比10∶1加入冰浴的超纯水，匀浆致无显著悬浮物转移到10 mL离心管中，4 ℃条件下5000 r/min离心15 min，取上清分装后-80 ℃超低温冰箱冻存备用。采用高效毛细管电泳法对大鼠内囊中的谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸等氨基酸类神经递质含量检测。将谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸标准液制成混合标准液，按2、4、8、16、32倍稀释成混合标准品。取组织上清液5 mL，加0.01 M的异硫氰酸荧光素25 mL和四硼酸钠缓冲液50 mL混匀，室温避光静置12 h。测定混合标准品和待测样品的峰面积。根据各浓度标样峰面积计算标准曲线及回归方程，并根据方程计算待测样品各指标含量。

(3)单胺类神经递质检测：实验采用荧光法分光光度法对大鼠内囊的单胺类神经递质进行检测。样品与(2)中所制备的样品相同。5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素分别按2、4、8、16、32倍稀释制成标准品。另取冻存2.5 mL，依次加入正庚烷5 mL、0.1 M盐酸1 mL振荡混匀，3000 r/min条件下离心5 min，取水相备用。取0.4 mL水相液体，依次加入0.05%半胱氨酸0.1 mL、邻苯二甲醛3.0 mL、0.02%高碘酸钠0.1 mL，沸水浴10 min冷却，在荧光值365/480 nm条件下，检测各浓度标准品和待测样品5-羟色胺的含量。取0.5 mL水相液体，依次加入乙酸缓冲液1. 5 ml、EDTA缓冲液0.4 mL、0.1 M高碘酸钠2 mL、碱性亚硫酸钠4 mL，沸水浴2 min冷却。使用荧光分光光度计在310/370 nm条件下，检测各浓度标准品和待测样品多巴胺的含量；在荧光值365/480 nrn条件下，检测各浓度标准品和待测样品去甲肾上腺素含量。根据各浓度标样计算标准曲线及回归方程，并根据方程计算待测样品各指标含量。

1.3 统计学方法

2 结果与分析

2.1 对大鼠上肢伸直幅度影响

表1显示，在术后第1天给药前，对照组和假手术组大鼠上肢伸直幅度比较差异无统计学意义(P>0.05)，但对照组和假手术组的上肢伸直幅度显著低于其余各组造模大鼠(P<0.05)。在给药第25天，模型组大鼠上肢伸直幅度依然显著低于对照组和假手术组(P<0.05)，各给药组大鼠上肢伸直幅度有增高趋势，并显著高于模型组(P<0.05)，而高剂量组大鼠上肢伸直幅度显著高于低剂量组(P<0.05)。

2.2 对大鼠内囊氨基酸类神经递质含量影响

表2显示，在给药第28天，模型组大鼠内囊γ-氨基丁酸含量显著低于其他各组(P<0.05)，高剂量组γ-氨基丁酸与对照组、假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)，并显著低于对照组和假手术组(P<0.05)，但与高剂量组和中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠内囊甘氨酸含量显著低于其他各组(P<0.05)，低剂量组甘氨酸显著低于对照组、假手术组和高剂量组(P<0.05)，但与中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组甘氨酸与对照组和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠内囊谷氨酸含量显著高于其他各组(P<0.05)，各给药组谷氨酸随着剂量的显著降低(P<0.05)，高剂量组与对照组和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠内囊天门冬氨酸含量显著高于其他各组(P<0.05)，低剂量组内囊天门冬氨酸显著高于高剂量组、对照组和假手术组(P<0.05)，但与中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组、中剂量组、对照组和假手术组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 对大鼠上肢伸直幅度的影响(cm)

注：与对照组比较：1)P<0.05)；与模型组比较：2)P<0.05

表2 对大鼠内囊氨基酸类神经递质含量的影响(μg/g)

注：与对照组比较：1)P<0.05)；与模型组比较：2)P<0.05

2.3 对大鼠内囊单胺类神经递质含量的影响

表3显示，在给药第28天，模型组大鼠内囊5-羟色胺、去甲肾上腺素含量显著低于其他各组(P<0.05)，各给药组的5-羟色胺、去甲肾上腺素随着给药剂量的增加有增加趋势，其中高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)，中、高剂量组与对照组和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和低剂量组大鼠内囊多巴胺含量显著低于其他各组(P<0.05)，对照组、假手术组、中剂量组和高剂量组间内囊多巴胺比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 对大鼠内囊单胺类神经递质含量的影响(ng/g)

注：与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨论

内囊是脑卒中的好发部位，当内囊发生损伤时将对下行神经的功能造成阻断。有研究指出，在正常情况下，α运动神经元和γ运动神经元通过相互制约、相互作用共同对肌张力起调控作用，并受到高位的中枢调控。当下行神经被阻断后，肢体则会出现肌张力过高造成的痉挛状况[6]。所以，内囊电损毁法常被用来制造大鼠脑卒中痉挛模型，该方法成功率高、动物模型死亡率也比较低。在本实验中，对照组和假手术组大鼠均能正常活动，而造模后大鼠则不同程度地出现不能完全伸展对侧前爪、向对侧转圈和倾倒的现象，但并未出现不能行走的大鼠，这说明本实验的造模是成功的。

脑卒中痉挛的主要临床表现就是肌群的肌张力增高，当脑卒中患者偏瘫肢体的肌张力增高时，其伸直的幅度则会降低[7]。在本研究中，模型组大鼠的肢体伸直幅度显著低于空白组和假手术组，说明模型组大鼠肌张力显著增加。在给模型大鼠进行芍甘木瓜汤药液灌胃治疗28 d后，脑卒中痉挛大鼠肢体的伸直幅度显著增加，表明模型大鼠的肌张力有不同幅度的下降，说明本实验所采用的复方药液可以有效降低脑卒中造成的肌张力增高现象，且有一定的药物浓度依赖性。

在用针刺法对脑卒中痉挛的治疗中，患者痉挛状态得到显著缓解，而其脊髓液中γ-氨基丁酸也显著增加，推测针刺法通过刺激患者体内γ-氨基丁酸分泌，从而对肌肉痉挛进行抑制[8]。甘氨酸是脑干和脊髓抑制性中间神经元的递质，但与γ-氨基丁酸不同的是，甘氨酸属于突触后抑制，无法对突触前抑制进行调节。甘氨酸及其前体物质具有增强运动反射突触后抑制的作用，如果采用抑制剂对甘氨酸受体物质进行拮抗，则会引起强烈的痉挛反应[9]。在本实验中，痉挛模型大鼠内囊中γ-氨基丁酸和甘氨酸的含量均显著低于对照组和假手术组。而给模型大鼠灌胃药液后，其内囊中的γ-氨基丁酸和甘氨酸含量显著增加，而增加量呈现出对药物浓度的依赖性。在1.0 g/100 g以上的给药量时，痉挛大鼠内囊中的γ-氨基丁酸和甘氨酸含量与正常对照组和假手术组比较差异无统计学意义，说明芍甘木瓜汤可以通过提高大鼠内囊中γ-氨基丁酸和甘氨酸的含量来抑制痉挛模型大鼠的肌痉挛。

实验结果显示，脑卒中痉挛模型大鼠内囊中的天门冬氨酸和谷氨酸含量显著高于对照组和假手术组，而灌胃芍甘木瓜药液后则显著降低，并且灌胃剂量为1.5 g/100 g时，与对照组和假手术组比较差异无统计学意义。说明芍甘木瓜汤能通过降低痉挛模型大鼠内囊兴奋性氨基酸神经递质含量，使脑受损后的中枢神经系统氨基酸代谢恢复平衡状态，缓解由于兴奋性氨基酸神经递质造成的肌肉痉挛状态。

研究表明，脑卒中模型大鼠脑组织中的单胺类神经递质显著降低，脑卒中患者脑脊液中的单胺类神经递质也是显著降低的[10]。在本实验中，脑卒中痉挛模型大鼠内囊中的5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素等单胺类神经递质显著低于对照组和假手术组，说明模型大鼠的中枢抑制作用显著下降，从而造成模型大鼠的肌张力提高。而在给模型大鼠灌胃芍甘木瓜汤后，5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素含量则显著提高，说明芍甘木瓜汤对脑卒中痉挛大鼠肌痉挛的治疗作用也与提高其中枢神经系统中单胺类的神经递质有关。

4 结论

偏瘫肢体肌痉挛是脑卒中患者术后恢复常见的后遗症，与脑受损后神经递质代谢的异常具有密切的相关性。本实验中，芍甘木瓜汤具有滋肝、舒筋、镇痛、活血、下行的药效。对脑卒中痉挛大鼠模型灌胃的研究表明，该药方可以通过改善脑受损后中枢神经系统中神经递质的代谢，抑制肌张力的提高，能有效缓解因脑卒中造成的肌痉挛现象。