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LDL与Raw264.7细胞中肾素-血管紧张素系统表达

2019-05-09刘南章程武舒佳武军驻通讯作者

医药前沿 2019年8期
关键词:孵育试剂盒引物

刘南 章程 武舒佳 武军驻(通讯作者)

(武汉大学基础医学院生物化学及分子生物学系 湖北 武汉 430071)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管系统中最常见的,威胁我国人民健康的慢性疾病[1],在发达国家其发病率和死亡率也很高[2]。AS是受损动脉的病变是从内膜开始的。LDL参与了AS的病变过程,LDL的氧化在慢性炎症反应中起着极其重要的作用[3-5]。血管紧张素(Angiotensin,Ang)是肾素-血管紧张素系统(RAS)中的多肽,可使血管收缩,进而导致血压升高。至今为止,4种血管紧张素肽(AngI、AngII、AngIII和AngIV)和四种血管紧张素受体(AT1、AT2、AT3和AT4)已经被鉴定[6]。无活性的AngI通过血管紧张素转换酶(ACE)转化为AngII。AngII代谢为AngIII,而后通过两种氨肽酶转化为AngIV。AngII和AngIII是AT1和AT2受体的完全激动剂。AngII是最有效的效应因子,通过调节血容量,血压,外周血管张力,在维持心血管系统的稳态中起重要作用[7-8]。但AngⅡ与LDL氧化之间的相互作用关系尚不清楚,本研究旨在探究LDL氧化过程中对肾素-血管紧张素系统的影响,为研究AngⅡ与LDL氧化之间的相互作用关系提供一定的依据。

1.材料与方法

1.1 主要试剂

实验室保存有Raw264.7巨噬细胞,LDL购自ProSpec-Tany公司。AT2R抗体来源于Abcam公司,GAPDH抗体来源于美国EarthOx公司。小鼠血管紧张素转化酶(ACE)试剂盒、小鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)试剂盒购自上海仁捷生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

小鼠RAW264.7细胞培养在含1%青霉素-链霉素,10%胎牛血清,90%DMEM的完全培养基中,置于5% CO2,90% 湿度,37℃的恒温培养箱中培养。

1.3 LDL处理

Raw264.7细胞达到80%-90%细胞密度时,换成无血清和双抗的DMEM培养基中同步化过夜,加入LDL(终浓度100μg/ml,含终浓度1μM的Cu2+),在培养箱中孵育不同的时间。用RIPA裂解液裂解细胞,离心取上清。

1.4 小鼠血管紧张素转化酶(ACE)试剂盒测定

ACE的活性 收集LDL刺激的细胞裂解后的上清,设置标准品孔和样本孔,分别加入对应的标准品和样品,空白孔不加;每孔加入检测抗体-HRP,空白孔除外;37℃孵育60min。洗涤液清洗5遍,每孔加入底物A和B,37℃避光孵育15min。每孔加入终止液,15min 内,在450nm 波长处测OD值。以测得标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线,得到直线回归方程,将ACE的OD值代入方程,计算出ACE的活性。

1.5 小鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)试剂盒测定AngⅡ的表达

收集LDL刺激的细胞裂解后的上清,设置标准品孔和样本孔,分别加入对应的标准品和样品,空白孔不加;每孔加入检测抗体-HRP,空白孔除外;37℃孵育60min。洗涤液清洗5遍,每孔加入底物A和B,37℃避光孵育15min。每孔加入终止液,15min 内,在450nm 波长处测OD值。以测得标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线,得到直线回归方程,将AngⅡ的OD值代入方程,计算出AngⅡ的含量。

1.6 Real-Time PCR检测ACE mRNA的表达

提取细胞总RNA,设计β-actin上游引物为5'-CTCCATCCTGGCCTCACTGT-3';下游引物为5'-GCTGTCGCCTTCACCGTTCC-3', 设 计ACE上 游引物为5'-TACAACTCCAGCGCCGAAC-3',下游引物为5'-GCCAGATCGGTTCATACAGC-3';逆转录42℃ 2min,37℃ 15min,85℃ 5sec。随后上机进行Real-Time PCR检测。结果处理:相对定量 2–ΔΔCt法。ΔCt(对照组)= Ct(对照组目的基因)- Ct(对照组内参基因),ΔCt(实验组)= Ct(实验组目的基因)-Ct(实验组内参基因),ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)。

1.7 Real-Time PCR检测

AT2R mRNA的表达 提取细胞总RNA,β-actin引物同上;设计AT2R上游引物为5'-ACAGGATAACCCGTGACCAAG-3',下游引物为5'-ACACTGCGGAGCTTCTGTTG-3';逆转录42℃ 2min,37℃15min,85℃ 5sec。随后上机进行Real-Time PCR检测。结果处理:相对定量 2–ΔΔCt法。

1.8 Western Blot检测AT2R的表达

将LDL刺激细胞后的裂解上清进行SDS-PAGE,180mA横流转膜2h,脱脂牛奶封闭2h,一抗4℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次,每次15min。二抗室温孵育2h后,TBST洗涤3次,每次10min。加ECL显影,随后用软件扫描灰度值分析条带。

1.9 统计学分析

用SPSS软件分析数据,计量资料用均数±标准差表示,运用Graphpad Prism5作图,用t检验P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 LDL刺激使ACE活性升高

LDL处理Raw264.7 0、5、10、15min,用ACE试剂盒测定ACE的活性变化:与对照组相比,酶的活性在刺激后5min(1.3667±0.1457,P<0.05)、15min(1.3767±0.1401,P<0.05)增高(图1)。

图1.LDL刺激Raw264.7细胞0、5、10、15min后ACE的活性变化n>3,*P<0.05

2.2 LDL刺激使AngⅡ表达升高

LDL处理Raw264.7 0、1、3、5、7、9、12h,试剂盒测定AngⅡ的表达:与对照组(797.6±12.46),相比,刺激后AngⅡ1h(952.5±21.28,P<0.05)、7h(969.63±20.82,P<0.05)表达升高(图2)。

图2 LDL刺激细胞0、1、3、5、7、9、12h后AngⅡ的表达变化n>3,*P<0.05

2.3 LDL刺激Raw264.7细胞后检测ACE mRNA的表达

LDL处理Raw264.7细胞0、1、3、5h:与对照组相比,刺激后3h ACE mRNA的表达升高(1.2533±0.1405,P<0.05),5h下降(0.7000±0.1100,P<0.05)(图3)。

图3.LDL刺激细胞0、1、3、5h后ACE mRNA的表达变化n>3,*P<0.05

2.4 LDL刺激Raw264.7细胞后检测AT2R mRNA的表达

LDL刺激Raw264.7细胞0、1、3、5h:与对照组相比,刺激1h(2.805±1.006,P<0.05)、5h(3.6700±1.0934,P<0.05)后AT2 mRNA表达升高(图4)。

图4.LDL刺激细胞0、1、3、5h后AT2RmRNA的表达变化n>3,*P<0.05

2.5 Western Blot检测AT2R的表达

LDL刺激Raw264.7细胞0、1、3、5h后,检测AT2R的表达:AT2R蛋白表达升高,3h(2.5967±0.7253,P<0.05)、5h(2.5933±0.6886,P<0.05)升高约2.6倍(图5)。

图5.LDL刺激细胞0、1、3、5h后AT2R的表达变化n>3,*P<0.05

3.讨论

研究表明,AngⅡ参与了AS的病理生理过程,血管紧张素II诱导的高血压会加重ApoE-小鼠中AS的发展[9]。LDL的氧化过程是一个多因子参与的过程,早期的研究已经表明人体注射血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)后血压的升高与血清 LDL 水平密切相关。近期研究发现AngⅡ会促进LDL聚集[10]。因此AngⅡ和LDL之间应该存在相互作用。

在本实验中,在LDL刺激5-15min内ACE的活性提高,从而使AngⅡ的含量在1h后也升高,因此LDL可以促进AngⅡ的表达;并且ACE mRNA、AT2 mRNA与蛋白表达都升高,说明LDL能激活RAS。因此天然LDL粘附于细胞被氧化成oLDL的过程中,血管紧张素转移酶(ACE)被激活,使AngⅡ表达升高,进一步LDL促进了ACE mRNA和AT2受体的表达,说明LDL激活了肾素-血管紧张素系统。

我们推测天然LDL氧化过程中,AngⅡ可能作为识别标签,通过识别受体AT1、AT2,介导细胞对LDL的氧化。本实验可作为AngⅡ与LDL相互作用的部分依据,后面会继续研究AngⅡ作用于LDL的方式,检测AngⅡ与LDL的相互作用方式,探究LDL氧化的分子机制。

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