付伟金, 谢智彬, 丁启健, 苏明昌, 赵越, 郑盛锋

广西医科大学第一附属医院泌尿外科(广西南宁 530022)

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)是GRP家族中的重要成员，与热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)有较高的同源性,是HSP 70家族的成员之一。GRP78在肿瘤组织如肝癌、结肠癌及乳腺癌、神经胶质瘤等过表达，并可能与肿瘤的凋亡、耐药密切相关[1-3]，本研究前期实验已证实GPR78在肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)中过表达，可能与RCC的发生、发展密切相关[4-5]。进一步研究证实GRP78过表达可能与肾癌细胞侵袭力及增殖等恶性生物学行为密切相关[6]。研究表明上皮间质变(epithelial mesenchymal transition,EMT)和肿瘤细胞侵袭力密切相关[7-8]。但GPR78如何调控肾癌细胞侵袭力，与EMT是否存在调节关系，以及通过何种信号通路调控细胞侵袭力，相关机制还不清楚。2016年9月至2017年12月本项目探讨慢病毒RNA干扰GRP78表达后对肾癌细胞侵袭力、EMT的影响及可能的相关信号调控通路，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾癌细胞株786-0细胞购自中科院上海细胞库，RPMI 1640培养液、胰蛋白酶、10%胎牛血清、转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，慢病毒siRNA购自上海汉恒公司，聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，PCR引物由上海生工公司合成，GRP78、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、p-PI3K、p-Akt抗体、GAPDH购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养及转染 肾癌细胞株786-0在RPMI 1640培养液中培养(含10%胎牛血清，5%CO2、37℃)。将处于对数生长期的786-0细胞按说明书用转染培养液和试剂转染，培养6 h后更换含有10%胎牛血清RPMI 1640培养液，慢病毒siRNA-GRP78干扰序列按文献[6]报道设计，干扰序列GAGCGCATTGATACTAGAAAT。转染48 h后在荧光显微镜下观察转染效率，随机选取10个视野拍照，并用Image Pro Plus软件计数分析，对照组不做任何处理，仅添加等量PBS。

1.3 Transwell实验检测细胞侵袭力 Transwell小室内铺满无血清培养液稀释的基质胶，取对数生长期的各组细胞，转染48 h后，将浓度为5×106·mL-1的细胞悬液加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培养液；培养48 h后，取出小室，PBS洗涤，棉签拭去小室上层未穿出细胞和基质胶，95%乙醇固定，用0.1%结晶紫染色。观察照相(×200)，按每组不少于4个随机视野计数穿出细胞,各组实验重复3次。

1.4 细胞克隆检测细胞增殖能力 各组转染48 h后，将细胞以500个/孔均匀接种于 6孔板,置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，10 d后当肉眼可见克隆形成时，终止培养；弃去培养基，用PBS洗3次，用4%甲醇固定，0.1%结晶紫染色后拍照，计算肉眼可见的细胞克隆数目，各组实验重复3次。

1.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 各组转染48 h后，将细胞接种于6孔板培养，待细胞铺满培养板底层时，用无菌200 μL加样枪头对细胞进行划痕损伤，每孔划痕1次，48 h后在显微镜下对每板的划痕随机选5个区域进行拍照，倒置显微镜下观察拍照(×100)，根据细胞间距计算迁移率，细胞迁移率=(愈合后间距/起始间距)×100%。

1.6 免疫蛋白印迹(Western blot)检测蛋白表达 转染48 h后，用细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，配置10%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔上40 μg蛋白进行SDS-PAGE后转至PVDF膜，封闭后，加兔抗小鼠GRP78单克隆抗体，4℃过夜。洗涤后加二抗室温孵育2 h，洗涤，DAB显色，成像，GAPDH作为内参，各组实验重复3次。

2 结果

2.1 干扰GPR78对肾癌细胞侵袭力的影响 Transwell实验结果表明，与对照组(295±12.8)个/视野细胞相比，siRNA组肾癌细胞明显减少，为(89.6±10.8)个/视野，组间比较差异有统计学意义(P<0.05),提示慢病毒RNA干扰GRP78后可抑制肾癌细胞侵袭力。见图1和表1。

A:对照组；B：siRNA组

项目n细胞克隆能力细胞侵袭力对照组3267.33±13.50307.33±19.42siRNA组3125.00±10.81∗207.00±17.52∗F值203.0444.13P值0.0000.009

*与对照组比较P<0.05

2.2 干扰GPR78对肾癌细胞克隆增殖能力的影响 细胞克隆实验结果表明，与对照组(281±21.8)个/孔相比，siRNA组肾癌细胞克隆(123±8.8)个/孔数量下降,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示慢病毒RNA干扰GRP78后可抑制肾癌细胞克隆增殖能力。见图2和表1。

2.3 干扰GPR78对肾癌细胞迁移活性的影响 细胞划痕实验结果表明，与对照组相比，siRNA组肾癌细胞迁移率下降,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示慢病毒RNA干扰GRP78后可抑制肾癌细胞迁移能力。见图3。

A:对照组；B：siRNA组

A:对照组；B：siRNA组

2.4 干扰GRP78对E-cadherin、N-cadherin、vimentin、p-PI3K、p-Akt蛋白表达的影响 与对照组相比，siRNA组E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)；N-cadherin、vimentin、p-PI3K、p-Akt表达下调，组间比较差异有统计学意义 (P<0.05)，提示慢病毒RNA干扰GRP78后可促进EMT上皮细胞标记物E-cadherin蛋白表达上达，间质细胞N-cadherin、vimentin表达下调，同时抑制PI3K/Akt信号通路中p-PI3K、p-Akt的表达，提示慢病毒RNA干扰GRP78后可逆转肾癌细胞EMT。见图4和表2。

图4 Western blot检测两组蛋白表达

3 讨论

RCC是泌尿系常见肿瘤。局限性RCC通过根治性手术可获得治疗，30%患者确诊已为晚期或转移，转移或晚期RCC患者5年生存率<10%[9]。因此早期诊断和寻找治疗新靶点对于RCC的治疗十分重要。越来越多的证据表明GRP78可能与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究前期发现GRP78在肾癌细胞组织中呈过表达[5-6]。与我们的研究结果一致，Kuroda等[10]也报道了GRP78在肾癌组织中过表达，并与RCC预后、复发呈正相关，提示GRP78可能与肾癌的发生、发展密切相关。与Lin等[11]和Kazushi等[12]研究结果相似，本研究前期发现沉默GRP78会促进肾癌细胞凋亡，抑制细胞增殖[6]，本研究还发现沉默GRP78后可抑制肾癌细胞侵袭力，降低细胞克隆及迁移力，提示GRP78可能具有致癌潜能。因为不同肿瘤细胞的发病机制不尽相同，与大多数研究结果不同，Chang 等[13]研究表明，GRP78表达降低可促进胃癌细胞转移，提示GRP78可能对不同类型的癌症表现出促肿瘤或抑瘤作用，因此还需要进一步研究明确GRP78在恶性肿瘤的相关调控功能。

项目nE-cadherinN-cadherinvimentinp-PI3Kp-Akt对照组30.48±0.070.82±0.490.68±0.070.74±0.150.72±0.04siRNA组30.75±0.70∗0.61±0.22∗0.57±0.13∗0.54±0.04∗0.46±0.05∗t值22.8099.5320.7472.0059.30P值0.0090.0010.0100.0010.002

*与对照组比较P<0.05

EMT与肾癌细胞侵袭和转移密切相关[14]。肾癌细胞发生EMT时，上皮细胞标记物如E-cadherin下调，而间质细胞标记物N-cadherin、vimentin上调，增加了细胞侵袭力，促进了远处转移的发生，因此抑制EMT是一种很有前途的肾癌治疗策略。为进一步探讨沉默GRP78后肾癌细胞侵袭及迁移力下降的调控机制是否与EMT 改变有关。本研究发现沉默GRP78下调增加了E-cadherin的表达，减少了N-cadherin和vimentin表达。本研究推测沉默GRP78后对肾癌细胞EMT起抑制作用，从而降低肾癌细胞侵袭及迁移力。而GRP78通过何种信号通路影响EMT目前研究少见。

研究证实PI3K/Akt信号通路广泛存在细胞中，是参与细胞生长、增殖、分化的重要信号通路[15-16]，PI3K/Akt信号通路可诱导肾癌细胞EMT[14]。本研究探讨了沉默GRP78表达后对肾癌细胞PI3K和Akt激活的影响。结果表明下调GRP78可显著降低肾癌细胞PI3K和Akt磷酸化水平。根据这些研究结果，本研究推测GRP78可能通过调节肾癌细胞中的PI3K/Akt信号而抑制EMT，从而影响上皮和间质细胞标记物表达，表现为E-cadherin上调，N-cadherin、vimentin表达下调，进而影响了肾癌细胞侵袭力,提示RNA干扰GRP78后可影响肾癌细胞的侵袭力。但肾癌细胞的侵袭力及EMT调控可能涉及多个信号通路及信号分子，因此需要进一步研究明确GRP78调控肾癌细胞侵袭力的具体机制。本研究下一步拟建立恶性肿瘤的裸鼠移植模型，进一步干扰GRP78表达后对肾癌细胞体内的影响。

综上所述，GRP78的下调可能抑制了EMT，进而促进E-cadherin 的表达，同时减少间质细胞标记物N-cadherin 和vimentin的表达，从而抑制了肾癌细胞侵袭、克隆和迁移能力，其机制可能与GRP78调控PI3K/Akt信号通路有关，提示GRP78有可能成为肾癌基因治疗的良好靶点和诊断标记物。