刘靖芷，史可梅，王晓娟，李全波，王慧星，付强，秦丽媛

外周神经系统脉冲射频（pulsed radiofrequency，PR）通过神经调控作用起到镇痛效果，可用于治疗顽固性疼痛［1-2］。研究显示，脊髓星状胶质细胞和小胶质细胞活化与痛觉过敏的产生和疼痛持续状态有密切关系［3-4］。有研究表明，炎性痛大鼠可见脊髓胶质细胞的活化［4-5］。脉冲射频对炎性痛及神经痛大鼠的镇痛作用已多见报道，但有关脉冲射频对脊髓胶质细胞活化的影响研究较少，脉冲射频镇痛机制尚未明确。本研究拟评价背根神经节脉冲射频术对炎性痛大鼠脊髓小胶质细胞标记物补体受体-3 的单克隆抗体（clone name of monoclonal antibody of complement receptor type 3,OX42）和星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达的影响，以期为阐明背根神经节脉冲射频术减轻炎性痛的机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 健康雄性SD 大鼠32 只，体质量200～250 g，6～8周龄，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。采用随机数字表法分为对照组（C 组）、脉冲射频组（PR 组）、炎性痛组（IP组）和炎性痛+脉冲射频组（IP+PR组）4组（n=8）。

1.2 炎性痛模型制备 除C 组和PR 组外，IP 组和IP+PR 组大鼠参照文献［6］方法制备炎性痛模型，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，俯卧位固定在固定器上，碘伏消毒右后足底，从右后足跖骨处缓慢注射2.5%福尔马林（上海锐聪科技发展有限公司）100µL，拔针后用消毒棉按压针孔，防止药液流出。C组和PR组同法麻醉下注射等容量生理盐水。

1.3 疼痛行为学测试 所有大鼠于造模前1 d 和造模后1、3、5和7 d于固定时间（14:00—17:00）在安静环境下参照文献［7］测定右后足机械缩足反应阈（MWT），将大鼠置于金属笼内20 min 后，采用BSEVF3 电子von Frey 纤维丝（Harvard Apparatus公司，美国）于右后足2、3趾骨间垂直施加压力，记录出现快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫反应时的压力，测定3次，间隔1 min，取平均值作为MWT，为防止鼠爪损伤，最大压力设置为50 g，超过此压力无反应则剔除。参照文献［8］测定热缩足潜伏期（TWL），将大鼠置于YSL-6B热痛仪（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）的热板上，记录从右后足接触热板到出现缩足反应、舔舐右足或嘶叫反应的时间，测定5次，间隔20 min，取平均值即为TWL，TWL上限定为30 s以防止烫伤，超过此时间无反应则剔除。

1.4 背根神经节脉冲射频 于造模后第4天（4 d）腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，俯卧位固定，背部剃毛备皮、碘伏消毒、75%乙醇脱碘后，触摸大鼠髂嵴最高点，即L5棘突，于L5棘突左侧切开皮肤，暴露约3 个棘突的距离，钝性分离腰背部肌肉，暴露棘突和椎旁肌肉组织，钝性剥离椎旁软组织，暴露L4-5横突及椎间孔，直视下沿神经根走行方向将射频电极穿刺针（22 G×50×4，英诺曼德医疗科技有限公司，德国）针尖置于L4-5椎间孔内背根神经节，R2000B北琪射频治疗仪（北京北琪医疗科技有限公司）进行阻抗测试，阻抗为400～550 Ω，确认射频针尖端位于神经组织，PR 组及IP+PR 组进行脉冲射频术（时间180 s、温度42 ℃）；C组及IP组仅将射频电极放置180 s。

1.5 Western blot 检测GFAP和OX42蛋白表达 于最后1次痛阈测定结束后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取L4-6脊髓组织，置于-80 ℃冰箱保存。制备脊髓组织匀浆，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用湿式电转移法（100 V，1 h），转至硝酸纤维素（PVDF）膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入GFAP 一抗（稀释度1∶500，Abcam 公司，美国）、OX42 一抗（稀释度1∶500，Abcam 公司，美国）及β-actin 一抗（稀释度1∶1 000，Abcam 公司，美国），4 ℃孵育过夜；加入HRP 标记的二抗（稀释度1∶5 000，Abcam 公司，美国）孵育2 h 后，室温孵育2 h，TBST 清洗3 次，每次5 min；DAB 显色，曝光、显影、定影。采用Quantity One 图像分析软件测定条带光密度值，以目的蛋白条带光密度值与内参β-actin条带灰度值比值反映目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，随机区组设计的计量资料采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验；重复测量设计的计量资料比较采用重复测量资料的方差分析，各组内多时点间比较用Bonferroni法，每个时点多组间比较使用多元方差分析法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠MWT 和TWL 的比较 各组大鼠MWT 和TWL 时间效应与干预措施间差异均有统计学意义，且存在交互作用（P＜0.05），见表1、2。（1）与造模前比较：C组与PR组造模后各时点与造模前比较差异无统计学意义，IP组与IP+PR组造模后MWT和TWL均较造模前降低（P＜0.05），见表1、2。（2）组间比较：造模前各组间MWT 和TWL、造模后各时点C组与PR组间差异均无统计学意义，造模后IP组与IP+PR组均较C组与PR组降低（P＜0.05），IP+PR组较IP 组于脉冲射频术后即d5 和d7 时升高（P＜0.05），脉冲射频术前即d1 和d3 时差异无统计学意义，见表1、2。

2.2 各组大鼠OX42 和GFAP 表达水平的比较 与C组和PR组比较，IP组和IP+PR组GFAP和OX42相对表达水平均上调（P＜0.01）；与IP 组比较，IP+PR组GFAP和OX42表达下调（P＜0.01），见图1、表3。

3 讨论

Fig.1 The Western blot results of GFAP and OX42 in four groups图 1各组大鼠GFAP和OX42的Western blot表达

福尔马林炎性痛模型广泛用于炎性痛的实验研究，通常给予福尔马林后约3 h大鼠出现舔足缩爪等明显的疼痛行为学表现，可持续1～2周，因此本研究选用福尔马林炎性痛模型。本研究结果显示，IP 组和IP+PR 组造模后与造模前比较，各时点MWT 降低，TWL 缩短，表明大鼠炎性痛模型制备成功。本研究参照文献［9］的方法行背根神经节脉冲射频术，与IP组比较，IP+PR组行脉冲射频术后（d5和d7）出现MWT 升高、TWL 延长，表明背根神经节脉冲射频术可减轻炎性痛大鼠的痛敏。

脊髓胶质细胞的活化可释放大量与疼痛传导和调节机制有关的活性物质，参与疼痛调节过程，与痛觉过敏的产生和持续状态有密切关系［3-5,10］。星形胶质细胞和小胶质细胞活化后可释放白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症介质及神经肽P 物质（substance SP），分别激活感觉神经元表面IL-1β和TNF-α受体及脊髓背角感觉神经元表面神经激肽-1 受体，可致神经元兴奋性升高，导致痛觉过敏，这些炎性介质参与疼痛的产生和维持［11-14］。小胶质细胞产生的补体受体-3的单克隆抗体为OX42，是小胶质细胞活化的标志物，疼痛产生时，OX42 表达水平增加，表明小胶质细胞活化［3,11］。脊髓星形胶质细胞活化时，其特异性标志物GFAP表达水平增加［13-14］，活化的星形胶质细胞表达谷氨酸转运体等，可改变突触间隙谷氨酸浓度，在痛觉调节中起着重要作用［13-15］，因此，本研究检测脊髓GFAP 和OX42 表达以分别反映星形胶质细胞和小胶质细胞的活化水平。本研究结果显示，与C 组比较，IP组和IP+PR组炎性痛造模后大鼠脊髓OX42和GFAP表达升高，提示炎性痛大鼠存在脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的活化；与IP组比较，IP+PR组大鼠行脉冲射频术后OX42和GFAP表达降低，表明背根神经节脉冲射频术可抑制炎性痛大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，结合疼痛行为学检测结果，提示背根神经节脉冲射频术减轻大鼠炎性痛的作用可能与抑制脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的活化相关。综上，背根神经节脉冲射频可降低炎性痛大鼠痛敏及抑制脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。

Tab.1 Comparison of MWT between the four groups表1 各组大鼠MWT的比较 （n=8，g，±s）

Tab.1 Comparison of MWT between the four groups表1 各组大鼠MWT的比较 （n=8，g，±s）

F组间=4 352.340，F时间=1 320.630，F交互=552.675，均P＜0.05；A与d0比较，a与C组比较，b与PR组比较，c与IP组比较，P＜0.01；各组内造模后多时点间不作比较；表2同

组别C组PR组IP组IP+PR组造模前（d0）24.77±0.35 25.03±0.43 24.92±0.52 24.86±0.49造模后d1 24.12±0.41 25.11±0.58 12.21±0.35Aab 11.97±0.57Aab d3 23.95±0.61 24.75±0.43 10.02±0.28Aab 9.87±0.43Aab d5 24.13±0.55 24.81±0.63 8.17±0.43Aab 15.77±0.88Aabc d7 24.37±0.46 25.32±0.71 6.77±0.27Aab 17.56±0.67Aabc

Tab.2 Comparison of TWL between the four groups表2 各组大鼠TWL比较 （n=8，s，±s）

Tab.2 Comparison of TWL between the four groups表2 各组大鼠TWL比较 （n=8，s，±s）

F组间=494.215，F时间=111.039，F交互=55.673，均P＜0.05；A与d0比较，a与C组比较，b与PR组比较，c与IP组比较，P＜0.01

组别C组PR组IP组IP+PR组造模前（d0）20.8±1.3 21.2±1.2 21.1±1.4 21.2±1.2造模后d7 21.3±1.4 21.1±1.2 6.9±0.9Aab 18.2±1.5Aabc d1 21.1±1.7 21.0±1.1 11.7±1.1Aab 11.4±1.2Aab d3 21.0±1.5 20.9±1.1 9.2±0.7Aab 9.3±0.9Aab d5 20.7±1.8 20.0±1.3 8.1±0.7Aab 15.7±1.3Aabc

Tab.3 Comparison of protein expressions of OX42 and GFAP between four groups of rats表3 各组大鼠OX42和GFAP表达水平的比较 （n=8，±s）

Tab.3 Comparison of protein expressions of OX42 and GFAP between four groups of rats表3 各组大鼠OX42和GFAP表达水平的比较 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a与C组比较，b与PR组比较，c与IP组比较，P＜0.05

组别C组PR组IP组IP+PR组F GFAP 0.61±0.10 0.63±0.09 1.12±0.18ab 0.91±0.12abc 29.301＊OX42 0.35±0.04 0.36±0.03 0.71±0.06ab 0.49±0.05abc 104.527＊