钟娟，陈静，青姚，吴曙粤，钟庆荣△

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）全身微血管病变的肾脏表现，也是DM 最常见且最影响其预后的慢性并发症。由DN所致的终末期肾脏疾病（ESRD）患者5年生存率低于20%，其已成为全球范围内ESRD 最主要的死亡原因，严重威胁着人类的健康［1］。DN 的发病机制十分复杂，迄今尚未完全明了，且缺乏有效的治疗药物。川芎嗪（Ligustrazine，TMP）是从中药伞形科植物川芎提取的总生物碱中分离的四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine），具有抗氧化、改善微循环、降血糖、抑制糖化产物的形成等药理作用［2］，临床上用于心、脑、肾及血管疾病等的治疗。笔者的前期研究已证实，TMP 可以通过降低血糖、改善血液黏度以及抑制醛糖还原酶活性从而改善DN 大鼠肾损伤［3］。本研究拟从PI3K/Akt/mTOR信号通路和自噬角度进一步探讨TMP对DN大鼠肾脏保护的作用机制，为DN的防治提供进一步的实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 8 周龄雄性SPF 级SD 大鼠108 只，体质量180～220 g，动物许可证号：SCXK 粤2006-0015，购自南方医科大学实验动物中心。所有大鼠均饲养于南方医科大学SPF级实验动物中心层流架内，置于空气流通，温度22～25 ℃，湿度40%～70%的环境中，给予12 h 光照，普通饲料喂养，自由进食及饮水。

1.1.2 药物与试剂 川芎嗪片购自北京市燕京制药厂（50 mg/片，批准文号：国药准字H11021964，生产批号160106）；厄贝沙坦片购自杭州赛诺菲制药有限公司（150 mg/片，国药准字J20080061，生产批号5A173）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司），兔源一抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、pmTOR、LC3B购自美国CST公司；鼠源一抗β-actin 以及HRP标记的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司；尿微量白蛋白及尿肌酐检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器 垂直电泳仪（美国Bio-RAD公司）；罗氏血糖仪（北京怡成生物电子技术有限公司）；microplate reader 酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；日立7180 全自动生化仪（深圳市永利鑫科技有限公司）；倒置显微镜XD101 型（南京江南光电股份有限公司）；Kodak Image Station 2000MM 成像系统（美国KODAK公司）。

1.2 方法

1.2.1 DN大鼠动物模型建立 所有大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表随机选取其中12只作为正常对照组，其余大鼠禁食12 h后，采用STZ腹腔注射，并予高糖高脂饲料喂养，具体造模方法和成模标准参考文献［3］。造模过程中死亡率约为16%。

1.2.2 动物分组及药物干预 模型大鼠随机分为模型组，TMP 低、中、高剂量组，厄贝沙坦组；另加正常组，共6 组（n=12）。TMP 分别按50、100、200 mg/（kg·d）灌服，厄贝沙坦予50 mg/（kg·d）灌服，模型组和正常组大鼠灌服等量生理盐水，1次/d，疗程为8周。

1.2.3 尿微量白蛋白与尿肌酐比值（UACR）检测 各组在药物干预前和干预后均进行UACR 检测，测量前禁食＞8 h，采集尿液标本，尿液标本采用酶法测定尿肌酐，免疫比浊法测定尿微量白蛋白，计算UACR。UACR以尿微量白蛋白（g）/尿肌酐（mol）表示。

1.2.4 肾脏病理检查 在最后1 次给药后，禁食12 h，称质量，以0.3%戊巴比妥钠按35 mg/kg腹腔注射麻醉，摘取肾脏，去除肾外层包膜，取厚度约4 mm肾组织，4%甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，再分别予苏木素-伊红（HE）和过碘酸-雪夫（PAS）染色，光镜下进行观察、拍照。

1.2.5 Western blot 检测PI3K/Akt/mTOR 信号通路及自噬标志蛋白LC3B 的表达 取冻存的肾组织，称质量后在研钵内用液氮迅速将组织研磨成粉末，将研磨的组织粉末转移到EP 管中。每50 mg 肾组织加入400µL RIPA 裂解液（含4µL磷酸酶抑制剂、4µL蛋白酶抑制剂），按蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白，采用BCA 蛋白定量法测各组蛋白浓度。Western blot 实验方法参考文献［4］，以β-actin 为内参，运用Image Station 2000R图像工作站取像，进行条带灰度分析。

1.2.6 免疫组化检测各组肾组织LC3B的表达 各组肾组织标本经4%甲醛固定后自来水冲洗5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后浸蜡和包埋，切取2µm的石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水洗后，现配3%H2O2，室温孵育20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗3 次后，取兔抗LC3B一抗工作液（1∶100）50µL覆盖组织片，置湿盒中盖上盖防蒸发，室温孵育60 min；PBS 漂洗3 次，滴加二抗，室温孵育30 min；PBS 漂洗3次后，配制DBA 显色剂，室温孵育5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加苏木素液约2滴至组织片上，5 min后流水冲洗干净，再滴加0.5%盐酸乙醇1 滴，约10 s 后自来水冲洗。中性树胶封片，光镜下观察。每组取6张切片标本，以出现清晰的浅黄色/棕褐色颗粒判定为阳性，采用Image Pro Plus 6.0（IPP）软件对目的蛋白的着色进行半定量分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理，数据采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多重比较采用Tukey 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMP 对DN 大鼠UACR 的影响 经药物干预前，模型组、厄贝沙坦组以及TMP 低、中、高剂量组与正常组相比，UACR 均显著升高（P＜0.05），但模型组与TMP 低、中、高剂量组及厄贝沙坦组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。经药物治疗8 周后，模型组大鼠UACR 与正常组相比显著升高（P＜0.01），各给药组UACR 均有不同程度的降低，但TMP 低剂量组与模型组比较差异无统计学意义，而TMP 中、高剂量组UACR 显著低于模型组（P＜0.05），且TMP 中、高剂量组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义（P＞0.05），提示中剂量TMP的治疗已能减缓DN大鼠UACR的升高，见表1。

Tab.1 Effects of ligustrazine on UACR in DN rats表1 川芎嗪对DN大鼠UACR的影响 （n=12，g/mol，±s）

Tab.1 Effects of ligustrazine on UACR in DN rats表1 川芎嗪对DN大鼠UACR的影响 （n=12，g/mol，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与模型组比较，c与厄贝沙坦组比较，P＜0.05

组别正常组模型组川芎嗪低剂量组川芎嗪中剂量组川芎嗪高剂量组厄贝沙坦组F治疗前120.50±33.53 196.25±66.43a 199.94±71.41a 202.73±64.77a 198.37±68.02a 196.03±73.18a 2.973＊治疗后131.04±53.58 350.32±96.50a 304.33±89.36ac 250.40±80.10ab 241.57±83.21ab 239.65±84.72ab 9.647＊＊

2.2 TMP 改善DN 大鼠肾脏病理的改变 DN 大鼠肾脏外观肿胀、质地变硬，经HE 染色后光镜下观察模型组大鼠肾组织可见大量的蛋白管型，肾小管上皮细胞脱落及空泡变性，炎性细胞广泛浸润于肾间质；PAS染色可见大量糖原沉积于肾小管和肾小球，肾小球系膜区扩大、细胞外基质显著增多。但经药物干预后，中剂量TMP 组与模型组相比，肾小管损伤明显减轻，肾小球系膜区基质增生显著减少，见图1、2。

2.3 TMP 对PI3K/Akt/mTOR 信号通路及自噬标志蛋白LC3B表达的影响 结果显示，模型组大鼠肾组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表达与正常组相比显著增加（P＜0.05）；而自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值与正常组相比明显降低（P＜0.05）。但经TMP 干预后，DN 大鼠肾组织p-PI3K、p-Akt、pmTOR 表达显著减少，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高，其中TMP 中、高剂量组与模型组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），但TMP 中、高剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

2.4 免疫组化检测TMP 对DN 大鼠肾组织LC3B 表达的影响 模型组大鼠肾组织LC3B 表达量与正常组大鼠相比显著减少（P＜0.05），而经中剂量TMP干预后，DN 大鼠肾组织LC3B 表达与模型组相比显著增多（P＜0.05），与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、5。

3 讨论

DN是由于长期慢性高血糖导致的肾脏损害，临床上以蛋白尿和进展性肾功能不全为特征，是全球范围内导致ESRD 的首要原因，严重威胁患者生命健康。自噬是细胞应对应激情况而出现的一种非损伤性应答反应，通过对自身胞质内细胞器和（或）物质进行包裹及吞噬，从而形成自噬小体，其进一步与细胞溶酶体融合，发展为自噬溶酶体，降解包裹及吞噬物。通过细胞的自噬，降解的产物可以重新供给细胞利用或者排泄出细胞，因此自噬对稳定细胞的结构、功能以及代谢平衡有着重要的意义。参与自噬调节的信号通路复杂，其中以PI3K/Akt/mTOR 信号通路最为典型［4-5］。

Fig.1 HE staining of renal tissues in four groups of rats(×200)图1 各组大鼠肾组织苏木素-伊红（HE）染色情况（×200）

Fig.2 PAS staining of renal tissues in four groups of rats(×200)图2 各组大鼠肾组织过碘酸-雪夫（PAS）染色情况（×200）

Fig.3 Effects of ligustrazine on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and protein expression of LC3B图3 川芎嗪对PI3K/Akt/mTOR信号通路及自噬标志蛋白LC3B表达的影响

Fig.4 Immunohistochemical staining of LC3B in renal tissues of rats(×200)图4 免疫组化检测TMP对DN大鼠肾组织LC3B表达的影响（×200）

Fig.5 Quantitative analysis of LC3B detected by immunohistochemistry staining图5 LC3B免疫组化阳性表达的定量分析

DM 时机体处于高血糖、高胰岛素血症、氧化应激、炎症反应等应激状态，通过自噬的调节可以增强机体的防御能力并减轻这些应激所致的损伤，进而延缓DM 及其并发症的发生与进展。研究发现，DN状态下，肾脏PI3K/Akt/mTOR信号通路被异常激活，自噬受到抑制，从而引起肾脏系膜细胞增殖、胞外基质积聚，导致肾脏损伤、肾小球肥大［6］。此外，Lu等［7］研究报道PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活可加速DN大鼠肾纤维化的发生与恶化。因此，自噬的改变与DN的发病机制密切相关，开发具有调控自噬作用的药物可能是预防或治疗DN的新靶点。

TMP是提取自活血化瘀中药川芎的一种生物碱成分，具有拮抗脂质过氧化、清除自由基、抗炎、抗微生物、改善血流动力学、抑制糖化产物的形成以及调节免疫功能等生物学活性作用，大量临床报道显示TMP治疗DN有着显著的疗效［8-9］。韩娇艳等［10］和刘中禄等［11］研究还发现，TMP 可以通过抑制PI3K/Akt和mTOR 介导的信号通路，从而降低前列腺癌PC3细胞增殖并促进其凋亡，进而发挥抗肿瘤效应。并且，潘盼盼等［6］基于以上信号通路，观察黄芪甲苷联合TMP 对DM 大鼠的肾脏保护作用及其机制，证实TMP 可以通过抑制Akt/mTOR 信号通路，降低固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）表达，从而改善DM 大鼠血糖、24 h 尿蛋白排泄、肾功能及肾脏病理改变，进而对DM大鼠肾脏具有保护作用。此外，文献报道TMP 还可以通过激活核因子E2 相关因子2（Nrf2）和抑制核转录因子κB（NF-κB），减轻DM 引起的肾损害［12］。本课题组前期研究也证实，TMP 可以通过降低血糖、改善血液黏度和抑制醛糖还原酶活性降低DN大鼠血尿素氮和肌酐水平、升高肌酐清除率［3］，但其具体作用的分子机制尚有待进一步探究。

本研究拟从PI3K/Akt/mTOR信号通路和自噬角度探讨TMP 对DN 大鼠肾脏保护的作用机制。并且，本研究根据美国肾脏病基金会的倡议和国内最近研究进展［13-14］，采用UACR 替代传统的24 h 尿蛋白定量检查。而厄贝沙坦减少蛋白尿和保护肾功能的作用已得到国际公认［15］，故作为阳性对照药。研究发现，DN 大鼠与正常组大鼠相比，UACR 显著升高，经8周干预后，各给药组UACR 均有不同程度的降低，但TMP 低剂量组与模型组比较未见显著差异，而TMP 中、高剂量组UACR 显著低于模型组，且TMP 中、高剂量组与厄贝沙坦组间比较未见显著差异，提示中剂量TMP的治疗已能减缓DN大鼠UACR的升高。同时我们也发现，经中剂量TMP 干预后，HE和PAS染色均显示DN大鼠肾脏病理改变明显减轻。而且Western blot 检测模型组大鼠肾组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表达与正常对照组相比显著增加，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值较正常对照组明显降低。但经TMP干预后，DN大鼠肾组织p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 表达显著减少，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高，其中TMP 中、高剂量组与模型组相比差异均有统计学意义，但TMP 中、高剂量组之间比较未见显著差异。此外，免疫组化进一步证实中剂量TMP的治疗显著增加DN大鼠肾组织自噬标志蛋白LC3B的表达。上述实验结果说明，TMP可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路，从而促进肾脏自噬，进而减轻系膜细胞增殖和胞外基质积聚、改善DN大鼠肾脏病理改变，降低UACR，减缓DN的发生与进展；而其有效剂量可以考虑为100 mg/（kg·d）。

综上所述，TMP 能降低DN 大鼠UACR 的升高、改善肾脏病理改变，其发挥以上肾保护作用的机制可能与其抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路，进而促进肾脏自噬有关。