姜 玮，畅柯飞，张铁华

（吉林大学食品科学与工程学院，吉林长春 130062）

鹿茸是脊索动物门、哺乳纲、鹿科动物马鹿和梅花鹿的雄性未骨化密生茸毛的幼角[1]，按动物源分为马鹿茸和花鹿茸。鹿茸是传统的名贵中药材，入药历史悠久，称之为“东北三宝”之一。据中国药典记载，鹿茸经炮制可为鹿茸片和鹿茸粉，味甘、咸，性温，归肾、肝经；具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒等功效；主要用于治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、赢瘦、神疲、畏寒、眩晕、耳鸣、耳聋、腰脊冷痛、筋骨痿软、崩漏带下、阴疽不敛等[2]。

1 国内外研究现状

我国对于鹿茸的精深研究始于20世纪90年代末期，从之前鹿茸外观的形态的研究转入到鹿茸活性成分的制备[3]、鉴定和活性机理研究[4]，研究水平已处于细胞和分子生物学水平。

在CNKI中，以“鹿茸”为主题检索，文献截止时间为2018年12月14日，通过“指数”分析的学科分布显示，鹿茸在“中药学”学科的比例最高为32.36%，伴随出现频率较高的词分别为鹿茸多肽、化学成分、药理作用、含量测定、多肽。

以“鹿茸”为主题CNKI中检索，研究的学科分布示意图见图1。

图1 以“鹿茸”为主题CNKI中检索，研究的学科分布示意图

在web of science中，以“deer antler”为主题检索，从图1分析可以看出，国际对于鹿茸的研究从1999年开始趋于热化。

以“deer antler”为主题在web of science中检索，每年发表文献数见图2，以“鹿茸多肽”为主题CNKI中检索，研究的学科分布示意图见图3。

图2 以“deer antler”为主题在web of science中检索，每年发表文献数

图3 以“鹿茸多肽”为主题CNKI中检索，研究的学科分布示意图

在CNKI中，以“鹿茸多肽”为主题检索，文献截止时间为2018年12月14日，发现鹿茸多肽在“中药学”学科的比例最高为75.85%，伴随出现频率较高的词分别为鹿茸、软骨细胞等。在web of science中，以“deer antler和peptide”为主题检索，总计检索到相关文章278篇，2005年后研究趋于热化，具体如图2所示。

以“deer antler”and“peptide”为主题在web of science中检索，每年发表文献数见图4。

图4 以“deer antler”and“peptide”为主题在web of science中检索，每年发表文献数

2 鹿茸多肽的制备

鹿茸多肽是从鹿茸中分离得到的一类分子量在0.2～10 kDa具有生物活性的肽占干鹿茸的50%左右。鹿茸多肽的提取方式较多，有水或乙醇浸提[5]、缓冲溶液浸提、酶解提取等。为保证加工过程中鹿茸的活性和营养的最大保存，研究者采取了很多处理办法，并申请了专利[6-9]。

2.1 溶剂浸提

鹿茸多肽传统的获取方式是煎煮和泡酒，并沿用至今，在日常生活中，很多家庭仍采用这种方式滋补。Jin H等人[10]研究了热水和超高压提取鹿茸多肽的方法，以得率为评价指标，热水浸提最佳提取温度90℃，提取时间20 h，料液比1∶29.34，提取率可达28.01%（W/W），糖醛酸为3.57 mg/g，葡聚糖为3.27 mg/g，唾液酸0.99 mg/g。超高压室温（25℃）提取最佳压力200 MPa，提取时间30 min，料液比1∶30，提取率达4.99%（W/W），糖醛酸为2.37 mg/g，葡聚糖为1.77 mg/g，唾液酸0.74 mg/g。Z G Sui等人[11]采用中性氯化钠溶液（0.15 mol/L，pH值7.0）、弱酸溶液（0.15 mol/L的乙酸溶液，pH值4.0）、弱碱溶液（0.15 M的甘氨酸——氢氧化钠缓冲溶液，pH值10.0）依次提取。董万超等人[12]十二烷基磺酸钠、巯基乙醇研磨提取，离心取上清液，经电泳分离后，多肽的分子量处于17 000～117 500 Da。随着科学技术的发展，现有采用高压脉冲电场[13]、超高压[14]、超声[15]等技术进行辅助提取。

2.2 酶解法提取

徐明等人[16]用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶水解鹿茸蛋白，以酶解度和多肽得率为指标，通过单酶和双酶组合试验发现，木瓜蛋白酶和复合蛋白酶的酶解效果最好，通过单因素试验和正交试验发现，其组合酶解的最适工艺条件为温度48℃，pH值7.2，底物质量分数7.5%，酶与底物浓度比6 000 U/g，2种酶比例为1∶1，酶解时间4 h，在此条件下酶解度为32.5%，多肽得率为72.8%。王华等人[17]采用碱性蛋白酶Alcalase酶解新鲜成年梅花鹿鹿茸，以对O2-自由基清除率为指标，通过正交试验优化，最适酶解条件为酶与底物质量比1∶150，底物与溶剂质量比1∶13，酶解时间60 min。张龙等人[18]采用碱性蛋白酶Alcalase酶解鲜鹿茸，降解率达到82%～93%，并就此申请了国家发明专利。

3 鹿茸多肽的氨基酸序列

鹿茸多肽与鹿茸的品种、采集部位、加工方式有关，不同品种的鹿茸成分含量存在差异，且同一品种鹿茸不同部位、不同加工方式的含量和种类也不相同[19]。

董万超等人[12]对成年梅花鹿茸的化学成分有较全面的分析，采用氨基酸自动分析仪检测含有11种游离氨基酸17种以上的酶解氨基酸，并测出了部分鹿茸多肽的分子量17 000，17 500，18 500，95 500，112 000，117 500 Da。李继海[20]采用pH值3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，浸泡梅花鹿茸匀浆过夜、离心，取上清液、醇沉，获得粗提物，经Sephadex G-50层析和CM-Sepharose Fast Flow柱层析得到一种活性多肽，SDS-PAGE电泳测得该肽分子量为3 200 Da，蛋白质含量达79.8%，主要含丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸等15种氨基酸。张郑瑶等人[21]通过乙醇醇沉、CM-SepharoseFast Flow离子交换层析SephadexG-50凝胶过滤层析和反相高效液相色谱层析（RP-HPLC）等技术分离纯化得到单体鹿茸多肽，SDS-PAGE电泳显示一条带，等电点PI=8.15，激光解析电离飞行时间质谱仪确定该单体多肽分子量为3 263.4，由32个氨基酸残基组成的直链多肽，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸，氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，且显示与来源于马鹿茸的32肽（分子量3 216.0，氨基酸序列为VLSAADKSNVKAAWGKVGGNAPAFGAEALLRM） 具有相似的功能活性，推测出4个有差别的氨基酸残基没有位于该肽的活性中心。严铭铭等人[22]通过SephadexG-25层析、DEAE-SepharoseFast Flow离子交换层析和反相C18柱层析，得到主要含缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸及脯氨酸的单一鹿茸多肽，氨基酸序列为EPTVLDEVCLAHGP，分子量为1 479.3。

已鉴定的部分鹿茸多肽氨基酸序列见表1。

表1 已鉴定的部分鹿茸多肽氨基酸序列

4 鹿茸多肽的功能活性

4.1 促进细胞增殖作用

翁梁等人[23]利用大鼠建立了皮肤机械损伤模型，3H-TdR掺入表皮细胞DNA合成为检测手段。体外研究表明，马鹿茸的总多肽含量为0.8，3.2 mg/g，膏剂外敷能够加速皮肤修复，从模型中分离出表皮细胞和软骨细胞；离体试验结果表明，马鹿茸总多肽和单体多肽能促进表皮细胞有丝分裂，并推测修复的机理是促进细胞增殖和分化。牛琼等人[24]采用肌肉注射、创口外用及二者结合的方式，考查了鹿茸多肽对大鼠皮肤机械损伤的影响。结果发现，肌肉注射、创口外用二者结合的方式愈合速度最快、创口细菌数最少、创面肉芽组织羟脯氨酸含量最高，与对照组有显著差异，创口外用的方式次之。王丰等人[25]通过阳离子交换层析、凝胶过滤层析、反相高效液相层析分离纯化鲜马鹿茸多肽，经SDS-PAGE电泳分析，该肽分子量约为3 500 Da。通过氨基酸组成分析，该肽主要含缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸，且N-末端氨基酸为缬氨酸，对大鼠乳鼠表皮细胞和BRL肝细胞具有明显的增殖作用。张郑瑶等人[21]采用3H-TdR掺入法，研究显示梅花鹿茸多肽对原代培养的表皮细胞和软骨细胞具有增殖作用，也能促进NIH3T3成纤维细胞株的分裂。严铭铭等人[22]采用MTT法研究了鹿茸多肽CNT14对HT22细胞具有特异性增殖作用，Swillc细胞（人结肠癌、乳腺癌细胞MCF-7）无增殖作用，从而推测其对阿尔茨海默病（老年性痴呆）具有治疗作用。陈东等人[26]通过免疫组织化学染色检测神经干细胞（NSCs） 分化为神经元和星形胶质细胞的状况，结果发现鹿茸多肽在体外可明显促进神经干细胞向神经元分化，体现出鹿茸多肽多因素、多因子的协同作用，且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。

4.2 抗氧化作用

郝林琳等人[27]通过乙醇沉淀获取马鹿茸多肽，在8 mg/kg的腹腔注射剂量下，鹿茸多肽能明显提高12月龄小鼠的SOD活性、降低MDA的含量，呈现出较强的抗氧化作用。王华等人[17]考查了鲜梅花鹿茸多肽（分子量小于800 Da）的抗氧化活性，在质量浓度为20 mg/mL时对超氧阴离子的清除率可达91.9%，质量浓度为10 mg/mL时，羟基自由基清除率达100%，呈现出剂量依赖关系；能够阻止脂质过氧化，且具有一定的还原力。

4.3 抗疲劳作用

鹿茸多肽具有抗疲劳作用。郝林琳等人[27]通过游泳试验发现，高剂量组（8 mg/kg） 比对照组的游泳时间延长了21.67 min。张睿等人[28]研究发现，鹿茸多肽能明显延长小鼠负重游泳时间、降低小鼠血乳酸和血清尿素氮的含量、提高小鼠体内肝糖原和肌糖原的储备量及运动后乳酸脱氢酶的活力，具有明显的抗疲劳作用。X D Luo等人[29]研究发现，鹿茸多肽能显著增加小鼠常压缺氧存活时间、断头喘气时间、爬杆时间和负重游泳时间，并能显著降低游泳后血清乳酸的增加量。

4.4 免疫调节作用

郝林琳等人[27]通过对受试小鼠的E玫瑰花环、溶血素检测和腹腔巨噬细胞吞噬功能检测，发现试验组小鼠的玫瑰花环成环率和巨噬细胞吞噬率显著高于对照组，高剂量组的溶血素OD值与对照组显著差异，表明鹿茸多肽具有免疫调节作用，且具有剂量依赖性。L Zhao等人[30]模拟胃消化系统提取，体外试验发现所提取的鹿茸多肽组分对小鼠脾细胞具有增殖作用。夏彦玲[31]研究了鹿茸醇提物和鹿茸粉对小鼠化学性、药物性、酒精性及免疫性肝损伤具有显著保护作用，且鹿茸醇提物的保肝效果好于鹿茸粉组,并推测鹿茸醇提物的良好效果是由于含有较多的多肽，这增强了小鼠的免疫调节功能，抑制炎症反应,减少肝组织TNF-α和IL等细胞因子的产生，从而对小鼠肝损伤起到了保护作用。

4.5 促骨生长作用

张洪长等人[32]探讨了梅花鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs） BMP-2和Runx2表达的影响，发现鹿茸多肽可使hBMSCs中的碱性磷酸酶活性增强，促进hBMSCs增殖分化，上调hBMSCs中骨形态发生蛋白2和骨特异性转录因子2基因和蛋白的表达，并推测这可能就是鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞骨形成及骨代谢影响的分子调控机制之一。

5 鹿茸多肽的毒理学评价

研究者对鹿茸多肽进行了急性毒性、亚慢性毒性试验、生殖毒性和致突变作用研究。急性毒性显示鹿茸多肽没有达到半数致死剂量[33]，属实际无毒物质[34]。亚慢性毒性试验显示，在正常摄入量的25，50倍时，受试组的血常规和血清生化指标与正常对照组差异不显著；在正常摄入量的100倍时，受试组的血常规和血清生化指标与正常对照组差异显著。

宋述辉等人[35]研究了鹿茸酒（58°酒浸出物∶38°酒=1∶1 000）的小鼠遗传毒性。研究发现，鹿茸酒组与38°酒组的小鼠精子畸变率呈现剂量依赖性关系，但二者之间没有差异，推测鹿茸无小鼠精子致畸作用；发育试验表明，鹿茸酒反而可有效降低38°酒对胎鼠存活、发育的影响；繁殖试验发现，鹿茸酒在一定浓度下，可以减少38°酒对F0，F1小鼠的繁殖能力影响，促进F2雄仔鼠的生长发育。在Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验中均显示鹿茸水提浓缩液没有致突变作用[35]。这2个研究的试验对象虽为酒、水浸出液，但浸出物中均含有鹿茸多肽。

6 鹿茸多肽的应用现状

6.1 鹿茸多肽在食品行业的应用

目前，市场上关于鹿茸的产品主要为鹿茸片，属于初加工产品，主要用于煲汤、泡酒，附加值不高。针对鹿茸精深加工的产品，也多为粉剂、胶囊、复合饮料[36]等。以“鹿茸”为发明名称检索，有效的授权发明专利79件。以鹿茸为原料研发产品，有火锅底料[37]、药酒[38-46]、保健中药（制品）[47-48]、鹿茸片[49-51]、饼干[52]、酸奶[53]、果冻[54]、口服液[55-57]等。

已经市场化的含有鹿茸多肽的部分产品见表2。

6.2 鹿茸多肽在化妆品行业的应用

鹿茸在化妆品行业崭露头角，已有公司开发了鹿茸相关化妆品，如鹿茸养颜宝系列、鹿茸青春宝系列、鹿茸多肽系列，是目前针对鹿茸开发的最全的鹿茸化妆品加工公司，并申报了国家发明专利“一种用于皮肤美容保健的复合鹿茸多肽冻干粉与纳米级缓冲微乳组合精华素及其制备方法”[58]，目前已经市场化含鹿茸多肽的化妆品鹿茸多肽紧致霜、鹿茸多肽保湿霜、鹿茸多肽抗皱霜、鹿茸多肽抗皱眼霜、鹿茸活性多肽因子组合(紧致型、提升型、抗皱型)、鹿茸多肽原液（提升型、抗皱型、紧致型） 和鹿茸多肽抗皱眼精华等。

表2 已经市场化的含有鹿茸多肽的部分产品

6.3 鹿茸多肽在医药行业的应用

目前，利用鹿茸的再生能力，已经在医药领域展开研究和应用，如伤口愈合[59]、抗炎、帕金森病等。新吉乐[60]探讨了鹿茸多肽对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的SH-SY5Y细胞急慢性损伤的保护作用，探讨鹿茸多肽对帕金森病的治疗可能性。还有通过考查脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7 NO的产生，研究了鹿茸多肽的抗炎活性。

7 结语

鹿茸在临床上具有悠久的应用历史，近年来关于鹿茸的研究也趋于白热化，尤其是针对鹿茸多肽，如胰岛素样生长因子（IGF-1）等。然而，尽管目前已有很多文献表明鹿茸极具潜力，无论在食品、医药、化妆品行业，但已市场化的鹿茸产品，尤其是鹿茸精深加工的保健产品仍然较少。究其原因，一是鹿茸开发的产品形式单一，受众面较小；二是针对鹿茸蛋白及多肽的化学及药理学方面的研究往往考查的是混合多肽，是宏观的表现，没有更进一步考查到底是什么活性肽起了作用，怎么起的作用。因此，运用现代生物技术分离多肽，寻找出具有代表性的生物活性物质，在此基础上开发鹿茸功能性产品，具有十分广阔的前景。