赵 丽，华 夏，谭 晔

（恩施土家族苗族自治州中心医院急诊科，恩施 445000）

胃癌是中国常见的恶性肿瘤之一，并且在全球肿瘤患者中占据第3位[1]。流行病学调查发现中国胃癌患者例数占全球的42%左右，每年死亡人数更是远远超过30万[2]。研究发现长期炎性因子的浸润是胃癌发生发展的一个重要诱导机制[3-4]。饮食习惯及生活方式也是诱发炎症或者肿瘤的重要原因，其中辣椒碱为辣椒中的主要活性成分[5]，长期使用过多的辣椒容易诱发胃黏膜炎症反应，并且一定浓度范围的辣椒碱可以诱发一系列炎症因子的高表达，还具有抗凋亡及促进血管生成等作用[6-7]。早期发现辣椒碱能诱导胃癌细胞的增殖[8]，但是与胃癌细胞转移的相关研究较少，并且炎症可以促使肿瘤细胞的转移[9]。笔者主要探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是否参与辣椒碱促使人胃癌MGC-803细胞转移，证实炎性通路在辣椒碱诱发MGC-803细胞转移的作用。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌MGC-803细胞 购买于武汉巴菲尔生物有限公司（来自美国ATCC细胞库）。

1.1.2 实验试剂 辣椒碱（山东绿叶制药，批号H20060291，纯度≥99%），白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（CUSABIO公司，批号 CSB-E04505m），白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（CUSABIO公司，批号CSB-E05207a），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒（CUSABIO 公司，批号 CSB-E02308d），活性氧（ROS）抑制剂 N-乙酰半胱氨酸（NAC，美国Sigma公司，批号CT-20161006），NLRP3抑制剂（美国 Sigma公司，批号CZ-20170614），NLRP3（批号 ab0252411）、细胞钙依粘连蛋白（E-cadherin，批号 ab1025855）、波形蛋白（Vimentin， 批 号 ab1102239）、β -actin （ 批 号ab2255027）抗体购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MGC-803细胞培养于10%胎牛血清（FBS）的完全达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养基（含1%的105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素）中，培养箱设置为37℃、5%CO2的恒湿条件，采用15 μmol/L辣椒碱干预MGC-803细胞48 h。采用1 μmol/L MCC950 及 1 μmol/L NAC 分别与辣椒碱共同干预MGC-803细胞48 h。

1.2.2 ELISA实验 取各组细胞（对照组、辣椒碱组、MCC950+辣椒碱组）培养液上清100 μL加入包被好的ELISA板中，37℃反应2 h，用洗涤液洗板3次，每次2 min。扣干后加入生物素化的一抗37℃反应1 h，用洗涤液洗板3次，每次2 min。扣干后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37℃反应30 min，用洗涤液洗板5次，每次2 min。最后加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）显色剂，反应时间为15～30 min，加入终止液，酶标仪450 nm波长下检测吸光度值。

1.2.3 Transwell实验 将对数生长期的MGC-803细胞接种于Transwell小室，贴壁后加入辣椒碱溶液及MCC950/辣椒碱混合液，药物干预上室MGC-803细胞48 h后，结晶紫染色测定迁移的细胞个数。

1.2.4 Western Blot实验 收集各组细胞，采用RIPA裂解液在冰上进行细胞裂解30 min，4℃、13 000 g离心力下离心15 min，吸去蛋白上清自新离心管中，采用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒进行蛋白浓度测定，加入适量样品缓冲液混匀，100℃煮沸7 min。用12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶块电泳分离蛋白，完成后转膜。切割不同分子量目的蛋白至对应一抗溶液中（稀释比均为1∶3 000），4℃震荡过夜，采用HRP标记的二抗（稀释比 1∶1 000）37℃孵育 1 h，TBST洗膜 3次后加入ECL显影液，采用X线曝光。

1.2.5 活性氧ROS检测 辣椒碱溶液及MCC950/辣椒碱混合液共同处理细胞48 h后，收集细胞悬浮于稀释好的2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，1∶1 000）液中，37℃细胞培养箱内孵育30 min。用无血清DMEM培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。流式细胞仪检测荧光强度。

1.3 数据分析 采用SPSS 20.0统计学软件处理数据，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 辣椒碱诱导MGC-803细胞产生炎性因子 辣椒碱组细胞培养液中IL-1β、IL-6及TNF-α含量相对于对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 辣椒碱通过上调NLRP3炎性小体诱导MGC-803细胞迁移 Western Blot实验结果发现辣椒碱组细胞中NLRP3炎性小体表达水平显著升高，同时E-cadherin蛋白表达显著降低、Vimentin蛋白表达明显升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。图3显示辣椒碱组细胞迁移细胞数相对于对照组显著增多，而辣椒碱+MCC950组细胞迁移数相对于对照组没有明显差异，并且发现MCC950干预细胞后，培养液中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量与对照组比较没有明显差异（P＞0.05），结果见图4。还进一步发现MCC950联合辣椒碱共同干预细胞后，NLRP3炎性小体表达水平显著降低，同时E-cadherin蛋白表达显著升高及Vimentin蛋白表达明显降低。

图1 MGC-803细胞培养液中炎性因子水平Fig.1 Levels of inflammatory cytokines in MGC-803 cell medium

图2 NLRP3、E-cadherin及Vimentin蛋白表达Fig.2 Expression of NLRP3，E-cadherin and Vimentin proteins

2.3 辣椒碱通过增加细胞内ROS的表达激活NLRP3炎性小体 辣椒碱组细胞内ROS含量显著升高，而NAC可以逆转辣椒碱诱导的ROS含量及NLRP3表达上调，结果见图5、图6。

图3 MGC-803细胞迁移能力（×200）Fig.3 Metastasis ability of MGC-803 cells（×200）

图4 MGC-803细胞培养液中炎性因子水平Fig.4 Levels of inflammatory cytokines in MGC-803 cell medium

图5 不同组间ROS水平比较Fig.5 Comparison of ROS in different groups

3 讨论

图6 不同组间NLRP3表达水平比较Fig.6 Comparison of NLRP3 expression in different groups

肿瘤细胞的迁移及侵袭是肿瘤进一步恶化的重要标志，并且细胞上皮间质转化（EMT）在肿瘤细胞的迁移侵袭过程中起着关键作用[10]。在肿瘤细胞出现转移过程中EMT往往处于活化状态，表现在间质样标志物Vimentin的表达升高、上皮样标志物E-cadherin表达降低等[11]。研究发现炎性反应可以促使肿瘤细胞的转移，而且炎性因子的产生还能够加快EMT进程，于是肿瘤炎症微环境促使了肿瘤细胞的侵袭及转移能力[12]。NLRP3炎性小体是主要的炎症调控元件，其表达上调会激活Cleaved casapse-1的水解成熟，从而诱导炎症因子IL-1β及炎性通路NF-κB的活化[13]。前期研究报道NLRP3炎性小体在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，并且其表达含量的提升可诱导胃肿瘤细胞的迁移及侵袭[14]。本研究发现用辣椒碱干预MGC-803细胞48 h后，NLRP3炎性小体表达显著上升，并且间质样标志物Vimentin表达升高、上皮样标志物E-cadherin表达降低，说明辣椒碱可诱导MGC-803细胞发生EMT，同时MGC-803细胞培养液中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量显著升高，说明辣椒碱可加剧MGC-803细胞炎症反应。然而采用NLRP3的特异性抑制剂MCC950干预MGC-803细胞后，可以解除辣椒碱诱导的细胞转移能力。

相关研究提示，氧化应激可以促使肿瘤细胞死亡达到肿瘤治疗的目的，作为机体发生氧化应激反应的主要分子，ROS能够诱导肿瘤细胞凋亡、坏死及自噬性死亡进而抑制肿瘤的恶化[15]。然而近年来报道ROS可以作为第二信使参与细胞内多种生理调节，进而介导肿瘤的迁移及侵袭[16]。机体产生的ROS可诱导NLRP3炎性小体活化，当细胞内NLRP3炎性小体受到ROS刺激后会使无活性的caspase-1前体进一步活化为有活性的caspase-1，后者能够把无活性的IL-1β前体剪切为IL-1β而分泌到细胞外，进而导致下游炎性通路的活化[17]。本研究发现辣椒碱可以促使胃肿瘤细胞内ROS的升高，而加入NAC干预细胞后能改善辣椒碱诱导的ROS增高，并且还减弱了细胞内的炎症反应，提示ROS在辣椒碱介导的胃癌转移中发挥了关键性作用，但辣椒碱诱导ROS产生的分子机制尚存在疑惑，需更深层次的研究。

总之，本文研究发现辣椒碱能诱导ROS产生进而激活NLRP3炎性小体，从而诱导胃肿瘤细胞发生EMT并促进胃癌转移。