孙音 伍明政 顾洛莎 白洁 顾劲松 于江 闫润虎 张怡

[摘要] 目的 探讨不同配比低温保护剂对冻存后人颗粒脂肪裸鼠移植的影响，以优化低温保护剂的选择。 方法 取人大腿内侧吸脂术后多余的颗粒脂肪，分别等量存入A、B两种不同配比的低温保护剂中，分别为A组和B组，置于-80℃冻存6个月。6个月后将标本复苏，移植于裸鼠背部皮下，各移植点注射0.2 mL颗粒脂肪。4周后处死裸鼠，取出移植物，进行体积、重量检测，并观察其苏木精-伊红（HE）染色、透射电镜下的情况。 结果 A组剩余脂肪平均体积大于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。HE染色示A组新生血管多于B组;透射电镜下A组脂肪细胞更加完整，新生脂肪细胞较多。结论 A组低温保护剂长期冻存的脂肪活性较高，且可用小牛血清取代胎牛血清;脂肪组织深低温冻存半年以后依然可以进行有效移植。

[关键词] 脂肪颗粒;低温保护剂;小牛血清;脂肪细胞活性

[中图分类号] R332;R622.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（b）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of cryoprotective agents with different proportions on transplantation of frozen human granular fat in nude mice in order to optimize the selection of cryoprotectants. Methods The excess granular fat after liposuction on the inner side of the thigh was taken into the cryoprotective agents of A and B in different proportions， group A and group B respectively and they were stored at -80°C for 6 months. After 6 months， the specimens were resuscitated and transplanted subcutaneously into the back of nude mice， and 0.2 mL granular fat was injected at each transplant site. After 4 weeks， the nude mice were sacrificed， and the grafts were taken out for volume and weight detection， and observed under hematoxylin-eosin （HE） staining and transmission electron microscopy. Results The mean volume of residual fat in group A was greater than that in group B， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. HE staining showed that the neovascularization of group A was more than that of group B. Under transmission electron microscope， the fat cells of group A were more complete and there were more new fat cells. Conclusion The long-term frozen fat of group A cryoprotective agents has higher activity， and fetal bovine serum can be replaced by calf serum. The adipose tissue can still be effectively transplanted after cryopreservation for half a year.

[Key words] Granule fat; Cryoprotective agents; Calf serum; Fat cell activity

脂肪組织冻存一定时间后仍具有活力并可进行临床移植，这已是不争的事实[1-4]。近年来，脂肪冻存及低温保护剂也逐渐成为脂肪移植的研究热点。低温保护剂在脂肪冷冻过程中起保护作用，能不同程度地保持冷冻脂肪组织活力，不同冻存条件下其最适宜的低温保护剂不尽相同。二甲基亚砜（DMSO）是常用冻存剂，其具有细胞毒性，常混合高糖培养基（DMEM）、胎牛或小牛血清一起使用。其中，胎牛或小牛血清作为保护剂，能够有效地提高脂肪组织冻存及移植后的成活率。胎牛血清价格十分昂贵，目前的研究趋向于使用小牛血清。然而，关于小牛血清的最适浓度尚无定论。本研究基于前人经验，选取30%、60%小牛血清配制成的冻存液进行相关研究，并比较其冻存后脂肪颗粒再移植的成活率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人脂肪颗粒  人脂肪颗粒标本（由广美整形美容医疗门诊部提供，患者已签署知情同意书）来源于行吸脂术的1名25岁的健康女性，吸脂部位为大腿内侧。将纯化好的脂肪颗粒分为2份，每份各2.5 mL，分别注入等量的A、B组低温保护剂中，将所有冻存管置入4℃冰箱，2 h后移入-20℃冰箱，4 h后移入-80℃深低温冰箱冻存6个月后复温。

1.1.2 实验动物  6只7周鼠龄的雌性BALB/c-nu同窝裸鼠（大连医科大学提供），合格证号：NO.21100370 0001087，分笼饲养于SPF级动物房。本研究经实验动物伦理委员会审查同意。

1.1.3 仪器与试药  仪器：深低温冰箱（美国赛默飞世尔科技公司）、倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）、透射电子显微镜（JEM-2000EX，日本电子株式会社）、冰冻切片机（美国赛默飞世尔科技公司）。

试药：二甲基亚砜（美国Amresco公司）、国产小牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）、高糖培养基（海克隆生物化学制品北京有限公司）、A组低温保护剂（配比为60%小牛血清、15%DMSO、25%DMEM）、B组低温保护剂（配比为30%小牛血清、15%DMSO、55%DMEM）。

1.2 方法

1.2.1 移植准备  ①将标本置于37℃水浴箱解冻，吸除溶解后的低温保护剂，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3次，加入DMEM待用。用1 mL注射器各抽取6组标本0.2 mL颗粒脂肪备用（填充注脂针头内的死腔后，每支注射器内的脂肪颗粒为0.2 mL）。②依据低温保护剂配比将大腿内侧脂肪颗粒标本分为A、B两组。6只裸鼠随机编号为1～6，于每只裸鼠背部左上、左下处标记移植区域及进针点，左上为A组，左下为B组。每个点位移植0.2 mL的脂肪量，将详细移植信息记录于每只裸鼠的信息卡片。③盐酸氯胺酮腹腔麻醉（100 mg/kg），依据体重计算所需麻醉药剂量，抽取后备用。

1.2.2 移植建模  裸鼠麻醉后标记移植部位，距移植部位下方1 cm左右消毒进针点附近皮肤，无菌针头刺破进针点，将备好的0.2 mL脂肪颗粒移植于裸鼠背部皮下。每个移植点间的间隔约2 cm，拍照、记录。

1.2.3 饲养观察  6只裸鼠饮食、生存条件一致。行移植术后前3 d，观察裸鼠有无死亡、移植物有无明显变化、移植处皮肤有无红肿，称重。其后，每周观察并记录一次裸鼠的上述基本情况、称重。

1.2.4 移植物取出与观察  4周后，于无菌条件下采用二氧化碳吸入处死裸鼠。沿裸鼠背部正中线纵向切开皮肤并进行分离，将移植物留于裸鼠背部（勿将移植物包膜划破，以免影响观察），观察其颜色、大小、表面毛细血管形成情况等，做好记录并拍照。见图1。

1.2.5 实验方法  ①微量天平称量移植物湿重、量水法测量体积，然后将每个移植物分为两份，取小米粒大小置于2.5%戊二醛（透射电镜用）备用，其余部分置于多聚甲醛（冰冻切片用）备用。平均体积减小率=（初始体积-取出移植物体积）/初始体积×100%，初始体积0.2 mL。②冰冻切片苏木精-伊红（HE）染色：脂肪颗粒置于多聚甲醛固定20 min后，转移至梯度蔗糖溶液脱水。OCT包埋后快速冷冻，冰冻切片机调至适温后修片，于-80℃冰箱保存。取冰冻切片，烤片后用PBS洗去包埋剂。HE染色后，梯度酒精脱水，二甲苯固定。中性树脂封片，显微镜下观察。③透射电镜观察：2.5%戊二醛固定液预固定2 h后PBS冲洗3次，四氧化二锇染色2 d，PBS冲洗2次后，梯度酒精脱水，移入环氧丙烷。经包埋、超薄切片后，单孔铜环收集切片，透射电子显微镜下观察脂肪细胞形态及其超微结构。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠及移植物生长情况

6只裸鼠移植后生长健康，注射部位无红肿、感染、破溃及坏死，注射点愈合良好，移植物全部成活。4周时间内，裸鼠体重随时间稍有增长。

裸鼠皮肤剥离后，移植物呈淡黄色，与正常脂肪组织颜色相近，质地柔软，表面有一层透亮、较薄的包膜，可见较细的血管生成。见图2（封三）。A、B两组移植物中，A组体积稍大于B组（图3）。

A组脂肪存活量高于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）;A组平均体积减小率低于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 透射电镜观察

电镜下可见成熟的脂肪细胞内被1个巨型脂滴所充满（图4A），细胞核呈扁圆形，被巨型脂滴挤于一侧;细胞边缘有少量体积较小的内质网、线粒体;细胞膜相对清晰明显。未成熟的脂肪细胞含较多分散的小脂滴（图4B）;细胞核呈椭圆形，着色较深，形态较饱满，位置较居中;较难分辨明显的细胞膜轮廓。脂肪细胞间有血管生成，血管内皮细胞清晰可见，血管内有双凹圆盘状成熟红细胞，新生血管附近的组织间隙内有较多成纤维细胞（图4C～D）。A组成熟脂肪细胞细胞膜较B组完整、致密;A组新生脂肪细胞多于B组，且观测到的新生血管多于B组。

2.3 HE染色观察

A组低温保护剂的标本可见新生脂肪细胞形态良好，排列均一，有明显小血管形成，血管数量较多、分布相对均匀，偶有空泡样缺损，未见明显囊腔及坏死。B组新生脂肪细胞大小均一，血管数目较A组略少，脂肪细胞排列紧密，体积较小，空泡样缺损较多，脂肪细胞形态及细胞膜不及A组清晰（图5）。因选取了移植物部分组织做透射电镜，HE染色组织切片不完整，切片方向也很难控制在横断面较多的角度，故未进行血管数目的统计。

3 讨论

脂肪颗粒冻存中可用小牛血清取代胎牛血清;冻存后移植，以60%小牛血清、15%DMSO、25%DMEM为低温保护剂的冻存效果较好;脂肪组织深低温冻存半年以后依然可以进行有效移植。

大量研究证实[5-6]，新鲜采集的自体脂肪组织由于离体时间短暂，各种生物活性均接近正常状态，移植存活率必定高于冷冻储存者。因此，本研究未采用新鲜脂肪作为参照。低温储存脂肪，-80℃和-196℃的冻存温度和满意度基本得到业界的一致认可，但目前多数研究[7-9]的儲存时间为数周至数月。目前，关于冻存剂各成分的比例的研究也少。综合考虑，本研究选择基本条件一致、-80℃下储存于A、B两种低温保护剂冻存半年后的人大腿内侧脂肪颗粒移植于免疫缺陷的裸鼠背部，根据移植物剩余体积、新生血管的生成量及脂肪细胞形态来判断其生物活性及移植效果。