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MMP-2 和MMP-9 在声带息肉中表达的比较及其相关性研究

2019-04-28宁金梅赵树波

云南医药 2019年2期
关键词:纤维细胞声带免疫组化

宁金梅,吴 平,钮 燕,赵树波,孙 勇

(1.曲靖市第一人民医院 耳鼻咽喉科,云南 曲靖 655000;2.昆明医科大学第二附属医院 耳鼻喉科,云南 昆明 650101)

已进行了大量关于基质金属蛋白酶(MMPs)在生理和病理情况下生物学行为的研究,MMPs通过降解细胞外基质、基底膜和其它蛋白,促进细胞转移,在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[1-12]。其中最重要的是明胶酶,包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9),其相对分子质量MMP-9为92 000(92KD),MMP-2为72 000(72KD),又称IV 型胶原酶,可有效降解基底膜的主要成分IV型胶原及明胶,还降解V,VII,X型胶原,弹性蛋白和层粘蛋白等,因此导致组织水肿、血管内细胞通过血管内皮基底膜迁移到血管外而引起一序列病理变化。有研究表明:MMP-2和MMP-9参与组织结构重塑,在炎症和肿瘤中表达量都显著增高[13,14]。研究发现MMP9的基质降解作用比MMP2 高出近25倍,MMP9 在粘膜内胃癌转移中的作用比MMP2更强[15-18]。我们前期研究已证实,声带息肉组MMP-2和MMP-9 阳性单位均值均>正常声带组,有统计学差异(P<0.05)。现进一步对MMP-2和MMP-9在声带息肉中表达进行比较,并进行相关性研究,以进一步探讨声带息肉的发病机制,为临床治疗声带息肉提供新的思路和理论依据。

资料与方法

一、临床资料 实验组:选择近年声带息肉患者标本35例,其中男性22例,女性13例,年龄24~62 岁,平均年龄为41岁,病程1月~8年,均经病理诊断确诊,且排除其他声带病变。所有患者均为初次手术。对照组:正常声带组织标本18例(因非喉部疾病死亡24~48h内的尸体标本,或病理科保存的正常声带组织标本蜡块)。

二、试验方法 2组标本经10%甲醛固定,石蜡包埋,作4μm 厚的连续切片,HE染色,选取标本中细胞成分多的部位作切片进行免疫组织化学染色。

三、结果判断 阳性判断标准:与迈新公司的阳性对照片中阳性细胞相比。相同或比其深者为阳性,比其弱或没有染色者为阴性。MMP-2和MMP-9 均以细胞浆出现黄色为阳性细胞,将每张切片着色强度与着色细胞数量进行分级。阳性细胞计数:0~5%为-,6%~15%为±,16%~25%为+,26%~50%为++,>50%为+++。阳性细胞表达强度:-无着色或染色与迈新公司的阳性对照片中阳性细胞相比比其弱,+黄色,++棕黄色,+++棕色。

四、图像定量分析 应用Nikon Eclipse 50i计算机图像分析仪,在400 倍镜下对行MMP-2 和MMP-9 染色的切片每张随机选取3个视野的上皮细胞和相邻的细胞间质。因声带息肉病理组织学变化多样,为增加研究的可比性,在MMP-2 和MMP-9 的连续切片中,选取的视野相同。用Nikon Mivnt 显微图像分析软件(WindowsXP版),每个视野随机圈定3个阳性单位(3个阳性细胞的细胞质),测定这3个阳性单位均值代表该视野的阳性单位均值。用阳性单位均值表示被染色物质的多少,阳性单位均值越大,说明物质的相对含量越高,即抗原物质表达的水平越高,反之亦然。

结 果

一、免疫组化观察结果

1.MMP-2 在正常声带和声带息肉中的表达MMP-2 定位于细胞浆,细胞核无着色。阴性对照片中未见阳性反应。MMP-2在正常声带和声带息肉中均呈程度不一的阳性反应,MMP-2在正常声带组中,阳性反应主要位于炎性细胞、成纤维细胞。在炎性细胞的表达:计数和表达强度均大多为++;在成纤维细胞的表达:计数为-~+,表达强度为-~++。血管内皮细胞、上皮细胞、横纹肌及软骨细胞也有表达,但表达较弱,见图1。MMP-2 在声带息肉组中,阳性反应主要位于上皮细胞、成纤维细胞、炎性细胞、和血管内皮细胞。在上皮细胞的表达:计数和表达强度均为+~++;在成纤维细胞的表达:计数为±~++,表达强度为+~++;在炎性细胞的表达:计数为:±~+,表达强度大多为++;在血管内皮细胞的表达:计数为:-~+,表达强度:-~++,大多为++。在间质也有表达,见图2~4。

2.MMP-9 在正常声带和声带息肉中的表达

MMP-9在正常声带组中,阳性反应主要位于炎性细胞、成纤维细胞和上皮细胞。不同的标本中各种细胞的表达可不一样,常以某一种细胞的表达为主,表达计数大多为+,强度多为+~++。也表达于血管内皮细胞、横纹肌和软骨细胞,见图5。在声带息肉组中,几乎所有切片上皮细胞、成纤维细胞、炎性细胞、和血管内皮细胞都明显表达MMP-9。在上皮细胞的表达:计数和表达强度均在+~++之间;在成纤维细胞的表达:计数大多为+~+++,表达强度大多为++;在炎性细胞的表达:计数多为+~+++,表达强度大多为++;在血管内皮细胞的表达:计数多为+~+++,表达强度大多为++,见图6~9。

结 果

一、正常声带和声带息肉MMP-2阳性单位均值比较

正常声带和声带息肉组间MMP-2阳性单位均值比较有统计学差异,见表1,声带息肉组阳性单位均值(30.5666±7.18438)>正常声带组(16.1361±4.32634)。

二、正常声带和声带息肉MMP-9阳性单位均值比较

正常声带和声带息肉组间MMP-9阳性单位均值比较有统计学差异,见表2,声带息肉组阳性单位均值(42.9661±9.80116)>正常声带组(16.6147±8.48336)。

三、声带息肉组织中MMP-9与MMP-2阳性单位均值比较

声带息肉组中MMP-9与MMP-2阳性单位均值比较有统计学差异,见表3,MMP-9阳性单位均值(42.9661±9.80116)>MMP-2(30.5666±7.18438)。

四、声带息肉组织中MMP-9与MMP-2表达的相关性分析

在进行相关性分析之前先用声带息肉中MMP-9 和MMP-2阳性单位均值做散点图,两变量之间不存在线性趋势,见图10,说明没有相关性,未做pearson相关分析。

讨 论

声带是声音的振动器官,声音产生的质量取决于声带独特的层次结构。对声带本身而言,其张力大小、长短、厚薄,皆对声音高低有影响[19]。声带固有层是与声带的发音功能直接相关的重要组织结构,特别是固有层浅层的形态和紧张度决定了声带振动的特性。发声过程中,声带振动最明显的是任克氏间隙,大多数声带病变起源于固有层,如果这一层出现炎症、新生物和瘢痕,声带就会变得僵硬,振动就会受到影响,音质就会发生改变[20]。细胞外基质的清除和合成之间的平衡是维持声带正常形态和功能的重要机制,声带息肉和Reinke's间隙水肿可能是基质的降解与合成失衡所致。细胞外基质的调节涉及许多蛋白质成分,如胶原和弹性蛋白,这些蛋白质的降解或再生由基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs),如明胶酶和弹性蛋白酶等的控制,而MMPs则受金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs) 调控。正常的细胞外基质有赖于基质蛋白、MMPs和TIMPs间的平衡。基底膜(basement membrane,BM) 是细胞和结缔组织交界处的细胞外基质,代表细胞外骨架、具有结构支持,细胞附着和选择滤过的功能。

在正常生理情况下,MMPs能调节细胞粘着、作用于细胞外成分或其它蛋白成分而启动潜在生物学功能、直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理功能[21]。病理情况下,MMPs 在炎症反应、血管生成及肿瘤侵袭、转移中发挥重要作用[22-24]。Vaiva Lesauskaite等[25]用免疫组织化学方法研究MMP-2和MMP-9在声带息肉组织中的表达,结果显示:MMP-9在上皮细胞的表达无论是声带息肉组还是正常声带组都显著强于MMP-2 的表达,这支持我们的研究结果。本实验中,用声带息肉中MMP-9和MMP-2阳性单位均值做散点图,两变量之间不存在线性趋势,说明没有相关性。我们推测MMP-9和MMP-2在声带息肉的表达可能存在着独立的调节机制,MMP-9和MMP-2 的上调或下调不会影响另一方的表达。

表1 正常声带和声带息肉MMP-2 阳性单位均值比较

表2 正常声带和声带息肉MMP-9 阳性单位均值比较

表3 声带息肉组织中MMP-9与MMP-2阳性单位均值比较

图1 MMP-2 在正常声带上皮和固有层中的表达(免疫组化MaxVisionTM法,×200);

图3 MMP-2 在声带息肉组织中的表达,着色于上皮细胞和纤维细胞(免疫组化MaxVisionTM 法,×400);

图4 MMP-2在声带息肉组织中的表达,着色于纤维细胞和炎性细胞(免疫组化MaxVisionTM法,×400);

图5 MMP-9 在正常声带组织固有层中的表达,主要着色于纤维细胞和炎性细胞(免疫组化MaxVisionTM 法,×200);

图6 MMP-9 在声带息肉组织中的表达,主要着色于炎性细胞和血管内皮细胞(免疫组化MaxVisionTM×200);

图7 MMP-9 在声带息肉组织中的表达,主要着色于上皮细胞和纤维细胞(免疫组化MaxVisionTM 法,×200);

图8 MMP-9 在声带息肉组织中的表达,主要着色于纤维结缔组织和血管壁(免疫组化MaxVisionTM 法,×400);

图9 MMP-9 在声带息肉组织中的表达,主要着色于血管内皮细胞(免疫组化MaxVisionTM 法,×200);

图10 声带息肉组织中MMP-9 和MMP-2 阳性单位均值散点图。

MMP-9和MMP-2在声带息肉中的表达明显>正常声带组织,差异有统计学意义,我们推测明胶酶可能在声带息肉的病理生理方面发挥着重要作用,参与了组织结构的重塑。MMP-9和MMP-2在声带息肉组织中的表达有统计学差异,MMP-9的表达明显>MMP-2,表明在声带息肉的发生发展中MMP-9似乎起到了更重要的作用。MMP-9和MMP-2 在声带息肉中的表达可能存在着独立的调节机制,其中一方的表达不受另一方的影响。对于声带息肉病人,同时抑制MMP-2和MMP-9,可望成为一种更好的治疗方案。

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