周礼华， 陈韩磊， 刘函冰， 韦 钰， 钱伟伟

(蚌埠医学院,安徽 蚌埠 233000)

拟除虫菊酯(Py)是一类人工合成的新型农药，由于其具有高效、广谱、低毒、低残留等特点而广泛应用，如用于防治农业害虫、防治家庭及公共场所中的卫生害虫等。目前，拟除虫菊酯类杀虫剂的应用已超过全世界杀虫剂的30%[1]。研究显示拟除虫菊酯暴露可削弱机体抗氧化防御系统，导致实验动物神经元退变，而神经退行性病变和导致老年痴呆的帕金森病紧密联系[2-4]。神经递质是神经元间、神经元与靶细胞间发挥信号传递功能的化学物质，作为信息传递体在中枢及周围神经系统中起重要作用。单胺类神经递质包括5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)等，单胺类神经元轴突投影可影响到每一个脑区，对整个大脑功能都有影响[5]。本试验选用Ⅱ型拟除虫菊酯类杀虫剂氯氰菊酯(CYP)作为代表，研究CYP对C57BL/6老年鼠脑皮层及血清中单胺类神经递质的影响，探讨拟除虫菊酯类杀虫剂对神经系统的毒性机制，为规范杀虫剂使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试动物

SPF级C57BL/6雌小鼠、雄小鼠各10只，鼠龄超过180天，购于南京市青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK(苏)2017-0001。供试动物在蚌埠医学院动物实验中心屏障系统内进行无菌饲养。系统内温度20～26 ℃，湿度40%～70%，试验期间自由摄入食物和饮水。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 CYP标准品(美国Sigma公司，批号：SLBH1254V)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：P0010)；5-HT ELISA Kit(批号：E-EL-0033c)、DA ELISA Kit(批号：E-EL-0046c)、NE ELISA Kit(批号：E-EL-0047c)，均购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2.2 仪器 台式高速冷冻离心机(Heal Force，Neofuge 15R)，全自动研磨仪(赛维尔，KH-III)，酶标检测仪(BioTeK，Epoch)。

1.3 试验方法

1.3.1 动物分组与处理 染毒前老年雄小鼠体质量27.87±1.06 g，老年雌小鼠体质量26.72±2.24 g，试验前各染毒组与对照组小鼠体质量无统计学差异。试验采用随机区组法，分别将雌、雄小鼠随机分成两组，其中，雄小鼠分为对照组及染毒组，雌小鼠分为对照组及染毒组，每组5只。CYP标准品用玉米油进行溶解，染毒组给予CYP 100 mg/kg腹腔注射，每日1次，连续4日。对照组以生理盐水代替。每日注射前称量小鼠体重，同时，观察供试小鼠的日常活动、精神情绪、摄食及饮水量的变化。

1.3.2 小鼠血清制备及单胺类神经递质的测定 腹腔注射结束后4 h，水合氯醛麻醉小鼠，随后进行摘取眼球取血，每只小鼠收集血液0.5 mL，置于EP管内，室温静置2 h，2 000×g离心15 min，分离血清，分装后保存于-80 ℃冰箱待用。按照试剂盒说明书的步骤测定血清中5-HT、DA、NE的含量。

1.3.3 小鼠脑组织的制备及单胺类神经递质含量的测定 在冰盘上摘取小鼠眼球血后，立即断头处死，依次剪开皮肤及颅骨，完整取出脑组织，分离大脑皮层。用生理盐水冲洗脑组织表面残留血液，滤纸吸干、称重、剪碎，按照重量1∶9加入预冷生理盐水，制成10%的组织匀浆。将匀浆液5 000×g离心10 min，取上清。严格按照试剂盒说明书步骤测定脑组织中5-HT、DA、NE的含量。BCA法测定生物样品中总蛋白浓度。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 小鼠一般情况观察

试验期间，对照组小鼠一般状况较好，神态无异常。染毒组小鼠精神萎靡，体毛蓬乱，眼角周围有不同程度的分泌物残留，身体有撕咬痕迹。试验期间各组动物无死亡现象。

2.2 小鼠体质量观察

如表1所示，染毒结束后老年雄小鼠体质量为28.45±1.67 g，老年雌小鼠体质量27.33±2.77 g，染毒前后雄小鼠、雌小鼠内部分组之间体质量差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 氯氰菊酯腹腔注射前后老年小鼠体质量变化

2.3 CYP对老年小鼠脑皮层5-HT、DA、NE的影响

试验结束，老年雄小鼠脑皮层5-HT、DA及NE的含量均低于对照组，其中5-HT和DA的含量与对照组差别显著(P<0.05)；同样，老年雌小鼠脑皮层5-HT、DA的含量高于对照组，与对照组差显著(P<0.05)(表2)。

表2 老年小鼠脑皮层5-HT、DA、NE含量比较

注：与对照组相比， a表示P< 0.05;A表示P< 0.01

2.4 CYP对老年小鼠血清5-HT、DA、NE的含量

试验结束，老年雄小鼠血清5-HT、DA的含量低于对照组，与对照组差别显著(P<0.05)，血清中NE的含量高于对照组，与对照组差别显著(P<0.05)；老年雌小鼠血清5-HT、DA及NE含量高于对照组，与对照组差别显著(P<0.05)(表3)。

表3 老年鼠血清5-HT、DA、NE含量比较

3 结论与讨论

氯氰菊酯急性染毒对C57BL/6老年雄小鼠及老年雌小鼠脑皮层及血清中单胺类神经递质5-HT、DA、NE产生影响，氯氰菊酯通过干扰C57BL/6小鼠机体神经递质含量而影响其神经系统的功能。

神经递质是神经元间、神经元与靶细胞间相互联系的桥梁，机体的某些生理功能是多种神经递质协同调控的结果。单胺类神经递质通过作用于神经元或效应细胞膜上的特定受体，完成各种信息的传递。单胺类神经递质包括5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等，这些神经递质在组织中的含量反映着神经递质生物合成、释放、摄取、失活等过程[6]。

单胺类神经递质含量的异常影响着神经系统的正常功能，进而干扰机体运动、睡眠和情感等活动。大脑多巴胺与肌肉协调能力密切相关，多巴胺含量下降时，运动能力下降[7]。Karen等发现, 高浓度拟除虫菊酯能够减少C57BL/6小鼠纹状体突触小体对多巴胺的摄取，影响小鼠的运动及摄食量[8]。多巴胺合成的速度主要取决于酪氨酸经化酶(Tyrosine transgenase，TH)，高剂量的拟除虫菊酯可能通过抑制TH 酶的活力，使其催化合成多巴胺含量减少[9]。5-羟色胺又名血清素，是一种神经递质和内源性活性物质, 广泛分布于中枢神经系统和周围组织中，具有营养因子的作用。5-HT需要通过相应受体的介导才能产生作用。脑中化学物质的残留会干扰5-HT的摄取和合成，氯氰菊酯代谢产物在脑组织残留会造成5-HT含量下降，进而降低神经递质水平，且降低程度与除虫菊酯的使用量及使用频率有关系[10]。拟除虫菊酯使钠离子通道关闭延迟，神经元去极化，进而干扰5-HT在纹状体内的正常传递，导致神经元过度兴奋[11]。

本试验以CYP (100 mg/kg)对C57BL/6老年小鼠进行急性染毒试验。结果显示，老年雄小鼠脑皮层及血清中5-HT、DA的含量明显低于对照组，与对照组差别具有统计学意义，这与Tripathi等的研究一致。而老年雌小鼠脑皮层及血清中5-HT、DA、NE的含量却高于对照组[12]。Aldridge等用有机磷农药毒死蜱暴露出生后的小鼠，发现小鼠体内5-HT含量会因雌、雄差异而含量不同，即5-HT的含量差异具有性别选择性[13]。Dam等在毒死蜱暴露幼年鼠的研究中也发现，雄鼠和雌鼠在协调性和运动能力方面受到的影响不同[14]。本研究发现CYP腹腔注射对C57BL/6老年雄鼠及雌鼠脑皮层及血清中5-HT、DA、NE的含量均产生影响，染毒组与对照组之间具有统计学差异，但是雌小鼠和雄小鼠的结果不一致。目前拟对除虫菊酯的研究主要集中在雄鼠，氯氰菊酯的毒性也可能具有性别差异性。同时，染毒剂量、染毒途径、染毒时间乃至试验动物的样本量也可能都是影响结果的因素，氯氰菊酯对单胺类神经递质5-HT、DA、NE的影响还需更加深入地研究。

综上所述，氯氰菊酯具有神经毒性，拟除虫菊酯类杀虫剂不可滥用。