吕博文 钱 钧 王 杰 钱景荣 卢莹莹 苏丽菊 杨桐树 李文辉

上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常见的病理类型，占全部卵巢癌患者的90%，由于其原发于盆腔深部，缺乏有效的诊断方法，70%患者发现时已处于癌症晚期失去了最佳手术时机。最新研究显示，上皮性卵巢癌患者病死率仍然较高，5年生存率仅为40%～50%[1-2]。迄今为止，上皮性卵巢癌发生发展的机制仍不完全明了，探索上皮性卵巢癌发生发展的分子机制，寻求有效的诊断治疗方法一直以来都是卵巢癌研究的热点。MicroRNA(miRNA)是一簇长度约为22个寡核苷酸的内源性单链非编码RNA分子，在植物、动物甚至一些病毒中高度保守。miRNA可以通过负向调控靶基因信使RNA(mRNA)稳定性和/或抑制靶基因mRNA翻译而发挥基因表达的负向调节作用[3-4]。大量研究证实，miRNA可以在肿瘤发生、发展的各个阶段发挥重要作用[6-8]。近年来累计的研究表明，miR-455-5p在多种肿瘤中发挥着重要作用，在子宫内膜浆液性腺癌[9]、基底细胞癌[10]、喉癌[11]以及肝细胞癌[12]中，miR-455-5p的表达水平与患者临床病理特征相关，可以作为预后及诊断的生物标志物；在黑色素细胞瘤中，miR-455-5p抑制CPEB1表达对肿瘤的转移有促进作用[13]。然而，目前miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的研究尚未见报道。本研究通过分析上皮性卵巢癌中miRNA表达数据，筛选miRNA差异表达谱，分析miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表达情况并进行qRT-PCR验证，随后应用生物信息学方法分析miR-455-5p靶基因参与的通路及功能，探讨miR-455-5p对上皮性卵巢癌发生发展的影响。

1 材料方法

1.1 miRNA数据

从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的GEO数据库下载上皮性卵巢癌miRNA表达数据GSE83693中四对上皮性卵巢癌和正常卵巢上皮miRNA表达数据。

1.2 试剂

培养细胞总 RNA 提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；逆转录荧光定量试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；人正常卵巢上皮细胞系IOSE-80细胞，上皮性卵巢癌细胞系 A2780、OVCAR3和SKOV-3细胞均购自中国科学院上海细胞库。

1.3 方法

1.3.1 差异表达miRNA筛选及注释 下载GEO数据库GSE83693数据集原始数据，选择上皮性卵巢癌数据4组(GSM2212808，GSM2212809，GSM2212810，GSM2212811)、正常卵巢上皮数据4组(GSM2212820，GSM2212821，GSM2212822，GSM2212823)。应用MAS 5.0算法对原始数据进行标准化预处理。使用R语言Limma程序包进行差异表达分析，筛选阈值为：Fold Change(差异表达倍数)≥|2.0|，P<0.05。应用pheatmap程序包绘制热图对差异表达miRNA进行无监督分层聚类。应用在线生物信息分析工具Sanger_V1.0.8绘制差异表达基因火山图。

1.3.2 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 应用DIANA TOOLS数据库对miR-455-5p的靶基因进行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，通路富集结果应用R语言软件ggplot2程序包绘制成柱状图。

1.3.3 GO(Gene oncology)功能注释分析 筛选KEGG分析肿瘤相关通路涉及的靶基因，应用DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)进行基因GO功能注释分析，设定阈值P<0.01，应用R语言软件ggplot2程序包绘制成柱状图。

1.3.4 细胞培养 人正常卵巢上皮细胞(IOSE-80)和上皮性卵巢癌细胞(A2780，OVCAR3，SKOV-3)置于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.3.5 qRT-PCR验证上皮性卵巢癌细胞中miR-455-5p的表达实验 利用Trizol-离心柱法提取细胞总RNA，以相应溶剂为对照(Blank)，取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280>2.0且<2.3，则可以满足后续qRT-PCR所需。参照RNA反转录试剂盒将RNA反转录为c DNA，引物序列：miR-455-5p上游引物5′-GCC GTA TGT GCC TTT GGA CT-3′，下游引物5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；U6上游引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。反应体系为20 μL：2×qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，ROX染料 0.4 μL，RT反应液(cDNA)2 μL，H2O 8 μL。反应程序：扩增曲线：95℃ 5 min 1cycle；95℃ 5 s，60℃ 31 s 40 cycles。熔解曲线：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s 。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 miRNA表达谱显示miR-455-5p在上皮性卵巢癌中呈现显著低表达

为探究miR-455-5p在上皮性卵巢癌中是否存在差异性表达，通过差异分析筛选出上皮性卵巢癌与正常卵巢上皮之间明显差异表达的miRNA，分析miR-455-5p是否包含其中。差异分析结果显示，共有明显差异表达miRNA 101个，其中上调miRNA 34个，下调miRNA 67个，其中包含miR-455-5p(表1)。分层聚类热图(图1)与差异表达火山图(图2)显示，在所有差异表达miRNA中，miR-455-5p呈明显低表达，与正常卵巢上皮样本相比差异倍数为-2.923，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 上皮性卵巢癌与正常卵巢上皮差异表达miRNA聚类分析热图Figure 1 Heat map and unsupervised hierarchical cluster of differential expression miRNA between epithelial ovarian cancer samples and normal ovarian epithelial samplesNote: T for tumor tissue;N for normal tissue;Color shows the expression of miRNA was reduced from red to green，and miR-455-5p was noticed use red line.

表1 上皮性卵巢癌中差异表达miRNA信息Table 1 Information for miRNAs differentially expressed in epithelial ovarian cancer

Note：logFC>0 means up-regulate and logFC<0 means down-regulate in ovarian cancer compared with normal ovary epithelium.

图2 上皮性卵巢癌与正常卵巢上皮差异表达miRNA火山图Figure 2 Volcano plots for the differential expression miRNA between epithelial ovarian cancer samples and normal ovarian epithelial samplesNote：Volcano plots show the relationship between fold change and statistical significance.The red and green dots in the plot denote up and down regulated by mi-RNA with a fold change ≥|2.0| and a P<0.05.The differential expression of miR-455-5p is noticed using a red arrow.

2.2 miR-455-5p表达情况验证

为验证miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的表达情况的预测结果，选择上皮性卵巢癌细胞系三种(A2780，OVCAR-3，SKOV-3)，正常卵巢上皮细胞系一种(IOSE-80)作为对照，应用qRT-PCR 检测miR-455-5p表达情况。qRT-PCT结果显示，上皮性卵巢癌细胞A2780，OVCAR-3，SKOV-3中miR-455-5p表达量明显低于正常卵巢上皮细胞IOSE-80，差异均有统计学意义(F=365.509，P<0.01)(图3)。

2.3 miR-455-5p调控的靶基因KEGG通路富集分析

为研究miR-455-5p下调对上皮性卵巢癌的影响，应用miRNA数据库TarBase v7.0对miR-455-5p调控的靶基因进行预测，共预测出受miR-455-5p调控的靶基因241个，通过DIANA TOOLS对这241个靶基因进行KEGG通路富集分析，结果显示，这些靶基因主要参与的通路共5个，包括有TGF-β信号通路(TGF-beta signaling pathway)，Hippo信号通路(Hippo signaling pathway)，ECM-受体相互作用通路(ECM-receptor interaction pathway)，癌症中的转录失调通路(Transcriptional misregulation in cancer)，慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia)(图4)，这些通路均与肿瘤发生发展相关。

图4 miR-455-5p靶基因KEGG通路富集分析Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis of miR-455-5p target genesNote：X axis.Gene Count；Y axis.KEGG pathway；Color shows P value which reduce from red to blue.

2.4 肿瘤相关通路中miR-455-5p靶基因的GO功能富集分析

为进一步分析miR-455-5p靶基因在上皮性卵巢癌中的功能，对参与肿瘤相关通路的靶基因进行GO功能注释，结果显示参与上述肿瘤相关通路的miR-455-5p靶基因共有13个(表2)，这13个靶基因主要参与蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation)，促进细胞增殖、迁移(Positive regulation of cell proliferation，positive regulation of cell migration)，抑制细胞凋亡(Negative regulation of apoptotic process)，促进上皮-间充质转化(Positive regulation of epithelial to mesenchymal transition，mesenchymal cell differentiation)，转录调节(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，transcription factor binding，negative/positive regulation of transcription，DNA-templated)及调控细胞周期(Cell cycle arrest)等多项功能(图4)，这些功能的失调与上皮性卵巢癌发生密切相关。

表2 肿瘤相关通路的miR-455-5p靶基因Table 2 miR-455-5p targeted genes in the KEGG pathway

图5 肿瘤相关通路中miR-455-5p靶基因GO功能注释分析Figure 5 GO functional annotation analysis of miR-455-5p targeted genes in cancer related signaling pathwayNote：X axis for Gene count;Y axis for GO functional annotation；Color shows P value reduced from red to blue.

3 讨论

上皮性卵巢癌发病机制不明、缺乏有效早期诊断标志、死亡率居高不下，已成为妇科肿瘤治疗过程中亟待解决的问题之一。目前，随着研究的深入，miRNA已逐渐被认为是肿瘤诊断及治疗的潜在生物学靶标。一些miRNA，如miR-200c、miR-30、miR-494等已证实在卵巢癌中存在差异表达并与肿瘤预后密切相关，可能成为潜在的诊断及治疗靶点[14-15]。因此，寻找与上皮性卵巢癌发生发展相关的miRNA，完善上皮性卵巢癌中miRNA表达及机制研究对于疾病的诊治至关重要。

以往的研究表明，miR-455-5p在多种肿瘤中存在表达失调，可作为癌或抑癌基因参与疾病发展，例如在非小细胞肺癌中，miR-455-5p通过靶向抑制SOCO3表达促进肿瘤细胞增殖及转移[16]；在乳腺癌中，miR-455-5p可以通过调节CDK14的表达发挥肿瘤抑制作用[17]。目前，关于miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的研究尚未见报道，为研究miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的表达情况，本研究通过分析上皮性卵巢癌miRNA表达情况，获得差异表达miRNA谱，预测miR-455-5p的表达情况，分析结果显示，miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表达明显下调，随后的qRT-PCR验证试验证实了表达谱的预测，与正常卵巢上皮细胞相比，miR-455-5p在上皮性卵巢癌细胞中的表达明显降低。

由于miRNA的功能主要是通过调控下游靶基因实现的，为进一步研究miR-455-5p下调对上皮性卵巢癌发生发展的影响，本研究利用生物信息学软件对miR-455-5p的靶基因进行了KEGG通路富集分析，发现miR-455-5p的靶基因主要富集在TGF-β信号通路、Hippo信号通路、ECM-受体相互作用以及癌症中的转录失调等通路，而以往研究已证实，这些通路的失调与肿瘤的发生密不可分，例如，在多种肿瘤中存在TGF-β信号传导失调，在肿瘤的发生、发展和转移中起关键作用，抑制其传导信号是癌症治疗的新兴策略[18]；在卵巢癌中，多种癌基因通过抑制Hippo信号通路促进肿瘤增殖、介导化疗耐药等[19-20]；在肾细胞癌中，通过调控EMC受体连接通路中相关蛋白的表达，可以发挥促进肿瘤增殖及转移的作用[21]。miR-455-5p的靶基因编码参与这些通路的重要蛋白，当miR-455-5p表达下降时这些基因表达失控进而影响这些肿瘤相关通路导致肿瘤发生。此外本研究还对参与这些肿瘤相关通路的靶基因进行了GO功能注释分析，结果显示，这些基因编码的蛋白大多参与促进调控细胞增殖、转移，抑制凋亡，调控蛋白质转录、磷酸化等肿瘤密切相关的功能，当miR-455-5p下调时，这些靶基因表达增多可能导致这些肿瘤相关功能的异常放大。

本研究通过筛选上皮性卵巢癌中miRNA差异表达谱，并从组织及细胞水平证实miR-455-5p在上皮性卵巢癌中表达呈显著下调；通过生物信息学分析发现miR-455-5p的靶基因编码的蛋白参与了多种肿瘤相关通路及功能，说明miR-455-5p下调在上皮性卵巢癌发生发展过程中起重要作用。然而，目前本研究仅对miR-455-5p靶基因的功能进行了初步的探讨，下一步，我们将着重对miR-455-5p在上皮性卵巢癌中的功能及机制进行实验研究。未来我们还将着重进行上皮性卵巢癌中miR-455-5p失调机制的探讨。miR-455-5p及其靶蛋白的相关研究有望为上皮性卵巢癌早期诊断、预后评估及临床治疗提供新的靶点。