朱欢叶 简月奎 李 波 高 淦 田 震 舒 嫚

凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin-1，TSP-1)是一个多功能细胞基质糖蛋白，参与许多生物学过程，比如血小板聚集、调节细胞增殖、细胞黏附、肿瘤生长、转移和血管生成[1-2]。在乳腺癌细胞中，TSP-1能够抑制细胞增殖和侵袭[3]。在肺癌细胞增殖和转移过程中，TSP-1蛋白的表达和恶性肿瘤发展之间呈显著负相关[4]。有研究证明TSP-1能够促进骨肉瘤细胞U2OS和SAOS的黏附[5]。另外亦有相关研究[6-7]发现TSP-1基因敲除后骨肉瘤细胞的增殖、迁移侵袭能力明显降低，并且进一步证明内源性TSP-1可以抑制骨肉瘤肺转移的血管生成，提示TSP-1基因能够影响骨肉瘤的血管生成。目前关于TSP-1对肿瘤的影响多数集中在乳腺癌、胃癌、肺癌等，对于骨肉瘤方面的研究甚少，其作用机制目前也尚不明确。本文通过TSP-1基因过表达和沉默的方式探索TSP-1对人骨肉瘤细胞MG-63功能的影响，以期为研究骨肉瘤的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 所用细胞系

人骨肉瘤细胞系MG-63购于上海中科院细胞库。实验前从液氮中取出冻存的细胞迅速放入37℃恒温水浴锅中解冻，期间不断摇动加速解冻。在超净工作台中迅速将细胞悬液转移到装有10 mL含10%FBS的RPMI1640培养基的离心管中混匀。用移液器将细胞转移至培养瓶中，并在培养瓶上标明细胞的代数及日期，置于37℃，5% CO2培养箱中继续培养。

1.2 方法

1.2.1 TSP-1过表达载体和干扰载体的构建 将TSP-1基因cds区片段克隆至PUC57载体构建过表达载体pBPLV-TSP-1。构建3条TSP-1基因干扰载体，干扰载体序列如表1所示。然后将干扰载体转染到MG-63细胞中，96 h后提取细胞RNA进行qPCR验证，筛选出效率最高的一条载体(pBPLV-shRNA-TSP-1 vector)进行后续实验。

表1 TSP-1干扰载体基因序列Table 1 Gene sequence of TSP-1 interference vector

1.2.2 实验分组 实验分为5组：MG-63细胞正常培养组(Control)；MG-63细胞+TSP-1表达空载体组(pBPLV-TSP-1 vector)；MG-63细胞+TSP-1干扰空载体组(pBPLV-shRNA-TSP-1 vector)；MG-63细胞+pBPLV-TSP-1组(pBPLV-TSP-1)；MG-63细胞+pBPLV-shRNA-TSP-1组(pBPLV-shRNA-TSP-1)。

1.2.3 CCK-8检测 取生长状态良好的MG-63细胞弃去培养液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化3 min，加入含10%FBS的1640完全培养基，将细胞吹打下来并吸取到10 mL离心管中，离心，弃上清，加入培养基重悬细胞，将细胞接种到96孔板中。置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养。约24 h后细胞长到每孔约为70%～80%时给药，继续培养24 h，加入CCK-8试剂，并后续测定吸光度值，计算各组细胞活力。

1.2.4 Transwell实验 将转染后的各组细胞种板前1天，血清饥饿12 h，常规消化、离心收集细胞，用低血清1640培养液(含0.2%FBS)混悬成单细胞悬液。将Transwell培养池放入24孔培养板中，上室内加入100 μL细胞悬液，下室内加入500 μL含10% FBS的1640培养液。将24孔板置于5%CO2，37℃培养箱培养48 h。取出侵袭小室将其中的培养基去掉，加入4%多聚甲醛，室温固定15 min后弃去固定液，加入适量PBS洗涤细胞，再加入Giemsa染色剂室温染色15 min后，取出小室，用棉签将小室内细胞擦去，显微镜拍照。

1.2.5 免疫荧光 将玻片置于细胞培养皿中进行细胞爬片，爬完后用4%的多聚甲醛进行细胞固定，然后用0.5%Triton X-100室温通透20 min，再在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，封闭完成后，加入一抗THBS1(1∶500)，p38 MAPK(1∶500)，CD36(1∶500)进行免疫反应，并放入湿盒，4℃孵育过夜。一抗孵育后加入荧光二抗Cy3(1∶200)放入湿盒中20～37℃孵育1 h，再滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，然后封片，最后进行图像采集。

1.2.6 qPCR检测 取细胞进行RNA的提取，提取RNA后用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR进行检测各组细胞中的TSP-1、CD36、p38MAPK、VEGF、VEGFR-1、EGF和PDGF等基因表达量。

1.2.7 Western blot检测 采用Western blot技术检测基因干扰后TSP-1蛋白表达以及血管生成相关因子CD36、EGF、P38、PDGF、VEGF、VEGFR-1的表达。将细胞进行收集并离心，加入相应的裂解液，4℃裂解30 min，在10 000 rpm离心10 min，小心吸取上清，即得总蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1～2 h，湿法转膜50～90 min。4℃孵育一抗溶液过夜；室温孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PCR验证TSP-1过表达载体和干扰载体的构建情况

用引物plvxpuro-F/plvxpuro-R进行PCR扩增质粒plvxpuro，理论上应有254 bp的条带，而TSP-1基因片段大小为3 525 bp，即TSP-1-plvxpuro经菌落PCR后，理论上会得到3 779 bp大小的条带，菌落PCR电泳结果如图1所示，电泳结果与理论值相符，有阳性点。

2.2 qPCR验证载体转染效率

与对照组相比，转染过表达空载体和干扰空载体之后细胞中TSP-1的表达量均没有明显变化(P=0.073，P=0.086)；与相应的空载体组相比，转染表达载体后，细胞中TSP-1的表达量明显升高(P<0.01)；而转染三条不同干扰载体后，其中一条干扰载体组表达量相较于空载体组明显下降(P<0.01)，其余2条干扰载体组均无统计学差异(P=0.078，P=0.083)(图2)。

图1 菌落PCR电泳验证载体构建Figure 1 Identification of colony PCR electrophoresisto vector constructionNote：M.DL15000 maker；1.Plvxpuroplasmid；2-10.TSP-1-plvxpuro.

图2 qPCR验证载体的转染效率Figure 2 The transfection efficiency of the vector was verified by qPCRNote：*P<0.05，when compared with the control.

图3 CCK-8检测TSP-1基因对细胞活力的影响Figure 3 Effect of TSP-1 geneon cell viability by CCK-8Note：* P<0.05，when compared with the corresponding emptyvector.

2.3 CCK-8检测TSP-1基因对细胞活力的影响

与对照组相比，转染过表达空载体和干扰空载体之后细胞活力均没有明显变化(P=0.075，P=0.081)；与相应的空载体组相比，转染过表达载体后细胞活力明显升高(P=0.023)，转染干扰载体后细胞活力明显降低(P=0.027)(图3)。表明TSP-1能够促进MG-63的增殖，提高细胞活力。

2.4 Transwell实验检测TSP-1对MG-63细胞侵袭能力的影响

与对照组相比，表达空载体组与干扰空载体组对细胞侵袭能力无明显差异；与表达空载体组相比，表达载体组细胞侵袭的数目明显增多(P=0.011)；而干扰载体组细胞数目相对于干扰空载体组明显减少(P=0.014)(图4)。

2.5 免疫荧光检测各实验组中CD36、P38、TSP-1蛋白表达情况

相较于对照组、表达空载体组、干扰空载体组，干扰载体组中的CD36(P=0.026，P=0.015，P=0.021)、P38(P=0.018，P=0.011，P=0.016)和TSP-1(P=0.019，P=0.024，P=0.031)表达量明显减少，而表达载体组中的CD36(P=0.036，P=0.024，P=0.028)、P38(P=0.033，P=0.029，P=0.017)和TSP-1(P=0.030，P=0.022，P=0.016)表达量则明显升高，说明TSP-1过表达能促进CD36、P38、TSP-1的表达，干扰载体pBPLV-shRNA-TSP-1能很好的抑制CD36、P38、TSP-1的表达(图5)。

图4 Transwell实验检测TSP-1对MG-63细胞侵袭能力的影响Figure 4 Effect of TSP-1 on invasion of MG-63 cells by Transwell experimentNote：* P<0.05，when compared with the corresponding empty vector and control.

图5 免疫荧光检测TSP-1基因对CD36、P38、TSP-1蛋白表达的影响Figure 5 The effect of TSP-1 gene on the expression of CD36，P38 and TSP-1 protein by immunofluorescence assayNote：The red fluorescence represents the expression of CD36，P38，TSP-1，and the blue fluorescence represents the nucleus.

2.6 qPCR检测TSP-1对相关基因表达的影响

qRT-PCR结果显示相对于对照组、表达空载体组，表达载体组的CD36、EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1表达量显著上升(P<0.01)，干扰载体组的作用正好相反，成功抑制了相关基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.01)(图6)。

图6 qPCR检测TSP-1对相关基因表达的影响Figure 6 The effect of TSP-1 on gene expression was detected by qPCRNote：* P<0.05，compared with control；# P<0.05，compared with empty expression vector；Δ P<0.05，compared with empty interference vector；^P<0.05，compared with expression vector.

2.7 Western Blot检测TSP-1基因对相关蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示了相对于对照组、表达空载体组，表达载体组的CD36、EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1表达量显著上升(P<0.01)，干扰载体组的作用正好相反，成功的抑制了CD36、EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1的表达，显示了良好的作用，具有统计学意义(P<0.01)(图7)，与qRT-PCR结果一致。

图7 Western Blot检测TSP-1基因对相关蛋白表达的影响Figure 7 The effect of TSP-1 on the expression of related proteins by Western blotNote：*P<0.05，compared with control；#P<0.05，compared with empty expression vector；ΔP<0.05，compared with empty interference vector；^P<0.05，compared with expression vector.

3 讨论

本研究结果表明TSP-1能够促进MG-63细胞的增殖和侵袭，促进血管形成相关蛋白的表达影响骨肉瘤的血管形成，这个作用与P38-MAPK信号通路有关。

血管生成在肿瘤生长和转移中扮演着重要的角色，是肿瘤细胞迅速增殖的前提条件，因此抗肿瘤血管生成治疗一直是肿瘤治疗的重要靶点，研究新型血管生成抑制剂对于肿瘤的治疗具有重大的意义[5]。大量的研究表明TSP家族中的TSP-1和TSP-2具有抗肿瘤血管生成作用，认为TSP-1是非常重要的血管生成抑制因子，能够抑制肿瘤的增殖和转移[7-9]。Lawler等的研究发现在p53缺失小鼠模型中，TSP-1缺失后小鼠患骨肉瘤的概率明显大于TSP-1过表达的小鼠[10]。与许多研究的结论不一致的地方在于本研究结果证明TSP-1能够促进MG-63细胞的增殖和侵袭能力。可能的原因在于类型不同，TSP-1在不同的肿瘤细胞中发挥不同的调控功能，许多在脑肿瘤、甲状腺瘤、黑色素瘤和前列腺瘤的研究发现TSP-1能够促进肿瘤的增殖和转移能力[11-14]。Chuanzhen等的研究也发现TSP-1能够通过FAK信号通路促进骨肉瘤U2OS和Well5细胞的增殖和侵袭[6]。这一结论与本研究结果是相一致的，本研究通过CCK-8和Transwell实验证明过表达TSP-1后MG-63细胞的增殖能力和侵袭能力均有明显升高，而通过shRNA干扰TSP-1的表达后细胞的增殖能力和侵袭能力明显下降。

为了探究TSP-1是调控MG-63细胞功能的可能机制，本研究采用了免疫荧光技术检测TSP-1基因过表达和干扰之后P38、TSP-1、CD36蛋白水平的表达变化。免疫荧光结果显示，过表达TSP-1后，TSP-1、P38、CD36的表达均有明显升高，而干扰TSP-1的表达之后TSP-1、P38、CD36表达明显下降，这个结果提示TSP-1调控MG-63细胞增殖和侵袭可能与P38 MAPK通路及肿瘤血管生成有关。现有的研究发现多种骨肉瘤血管生成相关的因子和患者的预后密切相关[15]。细胞因子FGF-2、VEGF、EGF、TGF-β都具有调节TSP-1表达的作用[13，16]。VEGF是作用最强的血管内皮生长因子之一，VEGF与其受体VEGFR结合后特异性地刺激血管内皮细胞有丝分裂，促进血管新生，同时VEGF作为一个强有力的肿瘤淋巴管生成因子促进淋巴系统肿瘤扩散，在肿瘤组织中的表达变化与肿瘤的血管化程度以及浸润、转移等生物学行为之间存在着密切的联系[17]。PDGF是一种受体酪氨酸激酶，在细胞的生长、增殖和分化中起重要的作用，PDGF通过与受体结合促进血管内皮细胞增殖分化，促进肿瘤的血管生成，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移[18]。

因此本研究进一步使用qPCR、Western blot技术检测了TSP-1干扰和过表达之后EGF、P38、PDGF、TSP-1、VEGF、VEGFR-1在蛋白和mRNA水平的变化情况。结果表明TSP-1基因干扰和过表达后MG-63细胞中VEGF、VEGFR、PDGF的mRNA水平和蛋白表达水平均有显著升高。在一些肿瘤细胞中，TGF-β和TSP-1之间存在一种正反馈调节，TSP-1的表达能够促进细胞因子TGF-β的表达，TGF-β的表达又能进一步促进TSP-1的表达[19-20]。这个结果提示TSP-1可能通过正反馈调节促进VEGF、VEGFR、PDGF的表达，从而促进骨肉瘤的血管形成。与Uchida的研究相一致，其研究发现在MG-63细胞中TGF-β能够促进TSP-1的表达[21]。Chen的研究也证明TGF-β能够诱导TSP-1的mRNA表达，这个作用是通过P38-MAPK信号通路介导的[22]。我们的实验中免疫荧光结果结合WB和qPCR结果表明TSP-1表达的上调会促进P38 MAPK蛋白及mRNA的表达。Yee等的研究证明TSP-1敲除会导致原发性乳腺肿瘤的发展，但是抑制转移瘤的发展[23]。也有研究证明TSP-1的表达可以促进肿瘤血管生成，是胃癌生存的良好预后因子[24-25]。所以我们有理由相信在MG-63细胞中，TSP-1可以通过正反馈促进细胞因子VEGF、VEGFR、PDGF的表达，从而激活p38 MAPK通路促进细胞增殖和侵袭能力及肿瘤血管生成。关于TSP-1基因的研究结果显示出了TSP-1基因与肿瘤关系的两面性，在不同的肿瘤中，TSP-1的表达对肿瘤血管生成具有不同的作用，其在每一种肿瘤中的作用机制仍需要更多的研究来阐明。

综上所述，TSP-1能够促进MG-63细胞生长因子VEGF、VEGFR、PDGF的表达，上调P38-MAPK通路，进而促进细胞的增殖和侵袭，影响骨肉瘤血管形成。