刘增亮，汪 茜，宋 娟，周双云，覃晓娟，车江旅，陈廷速*

(1.广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007；2.广西农业科学院园艺研究所，广西 南宁 530007；3.广西农业科学院蔬菜研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】生姜(ZingiberofficinaleRosc.)属多年生草本植物，在亚洲地区多被用作传统药物[1]，也是世界范围内广泛应用的主要香辛类保健蔬菜[2]。我国生姜栽培历史久远，2018年栽培面积达29.9万hm2[3]，在食品、医药和化妆品等多个行业均有应用[4]。随着生姜种植面积的不断扩大和种植规模化，姜瘟病、茎腐病和斑点病等病害也日益严重，经济损失巨大。目前对这些病害的防治以化学农药防治为主，大量使用化学药剂导致环境污染和抗药性增加，也危害人体健康。内生真菌特别是内生木霉菌是植物病害生防微生物的重要来源[5]，其抑菌机制多样，生防潜力巨大。因此，探究生姜内生木霉菌株的生态学特性，对该菌株的发酵生产、制剂研制及田间应用于姜瘟病、茎腐病和斑点病等病害防治具有重要意义。【前人研究进展】内生木霉菌广泛分布于可可[6]、茶树[7]、香蕉[8]、芦荟[9]、芦竹[10]、银杏[11]、红豆杉[12]、板蓝根[13]、枸骨[14]、滇牡丹[15]、香榧[16]、杨树[17]和枇杷[18]等植物根际。王莉衡等[9]研究显示，库拉索芦荟内生哈茨木霉LH-7对9种常见植物病原真菌具有显著的抑制作用(抑制率为62.4 %～88.4 %)，该菌株的代谢产物含有抑制病原菌生长及孢子萌发的活性物质，可导致病原菌菌丝体生长畸形、细胞壁破裂、产孢结构发育不健全、孢子形成及萌发率降低，从而有效抑制病原菌的生长和繁殖。王国平等[12]研究显示，用红豆杉内生木霉菌防治水稻纹枯病，防效达63.82 %，与50 μg/mL井冈霉素A的防治效果相当。杨蕾等[17]从杨树内生菌中筛选出1株杨树溃疡病拮抗真菌YGF9，其对杨树离体组织溃疡病防治效果可达76.47 %，是防治杨树溃疡病的潜在生防菌株，初步鉴定该菌株为黄绿木霉(Trichodermaaureoviride)。鲁海菊等[18]测定分离自黄瓜及枇杷的12株内生木霉菌对枇杷根腐病病菌的抑制效果，结果表明12株内生木霉对枇杷根腐病病菌均有抑制作用，菌株P3.9抑菌率最高，达80.1 %。【本研究切入点】目前，关于生姜内生木霉菌的研究未见报道；本课题组前期对生姜内生真菌进行了分离筛选，得到一株拮抗生姜茎腐病菌和香蕉枯萎病菌的内生真菌BJM-11，并将其鉴定为绿色木霉(Trichodermaviride)，菌株BJM-11生防潜力巨大，但对其生长和产孢所需温度、pH、碳源和氮源等影响因子的了解甚少。【拟解决的关键问题】采用菌落生长法和血球计数板孢子计量法，对木霉菌株BJM-11进行详细的生态学特性分析，明确其生长及产孢条件，为该菌株的发酵生产、制剂研制及田间应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

内生真菌BJM-11分离自从广西百色采集的生姜健康根系，结合形态学和分子生物学方法鉴定为绿色木霉(Trichodermaviride)，由广西农业科学院微生物研究所土壤微生物研究室分离保存(保藏编号为CGMCC NO.17196)。

1.2 试验方法

1.2.1 温度对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响 将内生真菌BJM-11在PDA平板上25 ℃下培养3 d后，从平板边缘取4 mm菌饼接种于PDA培养基，然后分别于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃条件下恒温培养，保持黑暗，48 h后十字交叉测量菌株BJM-11的菌落直径，7 d后镜检孢子数量，每处理5次重复。

1.2.2 pH对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响 将PDA培养基的pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0(PDA培养基在pH低于4.0时无法凝固)，将直径约4.0 mm的BJM-11菌饼接种于上述不同pH的PDA平板中央，25 ℃恒温培养，保持黑暗，48 h后测量菌株BJM-11的菌落直径，7 d后镜检孢子数量，每处理5次重复。

1.2.3 光照对内生真菌BJM-11菌丝生长和产孢的影响 将接种直径约4.0 mm BJM-11菌饼的PDA平板分别置于光照条件设定为24 h连续黑暗、24 h连续光照和12 h光暗交替(12 h光照+12 h黑暗)的恒温培养箱中，25 ℃培养，48 h后测量菌株BJM-11的菌落直径，7 d后镜检孢子数量，每处理5次重复。

1.2.4 碳源对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响 以查氏培养基作为基本培养基，以葡萄糖、木糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麦芽糖8种供试碳源等量替换(添加量均为3 %)蔗糖配制成含不同碳源的培养基，将直径约4.0 mm的BJM-11菌饼接种于上述碳源培养基中央，每处理5次重复，25 ℃恒温培养，保持黑暗，48 h后测量菌株BJM-11的菌落直径，7 d后镜检孢子数量，每处理5次重复。

1.2.5 氮源对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响 以查氏培养基为基本培养基，以钼酸铵、硝酸铵、亮氨酸、酵母浸粉、尿素、硝酸钾、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏11种氮源等量替换(添加量均为0.2 %)硝酸钠配制成含不同氮源的培养基，接种直径约4.0 mm的BJM-11菌饼，每处理5次重复，25 ℃恒温培养，保持黑暗，48 h后测量菌株BJM-11的菌落直径，7 d后镜检孢子数量，每处理5次重复。

1.2.6 不同培养基对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响 将直径约4.0 mm的BJM-11菌饼分别接种到PDA、马铃薯蔗糖琼脂(PSA)、玉米粉琼脂(CMA)、查氏和NA 5种培养基上，25 ℃恒温培养，保持黑暗条件，48 h后测量菌株BJM-11的菌落直径，7 d后镜检孢子数量，每处理5次重复。

1.3 统计分析

试验数据采用SPSS 20.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同温度对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响结果

从图1-A可看出，菌株BJM-11在10～35 ℃范围内均可生长，在20～30 ℃范围内菌丝生长较好，在25 ℃时菌丝生长最好，在10和35 ℃条件下菌丝生长缓慢，在5和40 ℃时几乎无法生长。其中，菌株BJM-11在25和30 ℃时的菌落直径较大，二者差异不显著(P>0.05，下同)，但均显著大于其他温度处理(P<0.05，下同)。从图1-B可看出，菌株BJM-11在10～35 ℃温度范围内均能产孢，适合产孢的温度范围为20～30 ℃，在5和40 ℃时几乎无法产孢。其中，在温度为25 ℃时产孢量最大，且显著大于其他温度处理，在温度为30和20 ℃时次之，二者差异不显著，但均显著大于其他温度处理。

综上所述，25和30 ℃较适宜菌株BJM-11菌丝生长和产孢。

2.2 不同pH对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响结果

从图2-A可看出，菌株BJM-11在pH 4.0～12.0范围内均可生长，在pH 4.0～10.0范围内菌丝生长较好。其中pH为5.0和6.0时的菌落直径较大，二者差异不显著，但均显著大于其他pH处理；从图2-B可看出，菌株BJM-11在pH 4.0～12.0范围内均可产孢，pH 4.0～10.0范围内产孢量效果较佳。其中菌株BJM-11在pH为5.0、6.0和7.0时的产孢量较大，三者差异不显著，但均显著大于其他pH处理。

综上所述，pH为5.0和6.0时较适宜菌株BJM-11菌丝生长，pH为5.0、6.0和7.0时较适宜菌株BJM-11产孢。

2.3 不同光照条件对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响结果

从图3-A可看出，菌株BJM-11在24 h连续光照、24 h连续黑暗和12 h光暗交替条件下均可生长。其中24 h连续黑暗处理的菌落直径最大，且显著大于其他光照处理。从图3-B可看出，菌株BJM-11在24 h连续光照、24 h连续黑暗和12 h光暗交替条件下均可产孢。其中在24 h连续光照条件下产孢量最大，且显著大于其他光照处理。

综上所述，24 h连续黑暗较适宜菌株BJM-11菌丝生长，24 h连续光照较适宜菌株BJM-11产孢。

图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2～6同Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05). The same was applied in Fig.2-6图1 不同温度对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响Fig.1 Effects of different temperature on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

图2 不同pH对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响Fig.2 Effects of different pH on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

图3 不同光照对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响Fig.3 Effects of different light on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

2.4 不同碳源对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响结果

从图4-A可看出，菌株BJM-11在供试的8种碳源培养基上均能生长，在碳源为葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麦芽糖时菌丝生长较好，在碳源为木糖时菌丝生长缓慢。其中碳源为葡萄糖和可溶性淀粉时菌落直径较大，二者差异不显著，但碳源为葡萄糖处理的菌落直径显著大于其他碳源处理；从图4-B可看出，菌株BJM-11在供试的8种碳源培养基上均能产孢，适合产孢的碳源为葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇和麦芽糖。其中碳源为甘露醇时，菌株BJM-11的产孢量最大，且显著大于其他碳源处理。

综上所述，以葡萄糖或可溶性淀粉为碳源较适宜菌株BJM-11菌丝生长，以甘露醇为碳源较适宜菌株BJM-11产孢。

图4 不同碳源对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响Fig.4 Effects of different carbon sources on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

图5 不同氮源对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响Fig.5 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth and sporulation of strain BJM-11

2.5 不同氮源对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响结果

从图5-A可看出，菌株BJM-11在供试的11种氮源培养基上均能生长，在氮源为钼酸铵、硝酸铵、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸钾、胰蛋白胨、甲硫氨酸、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏时菌丝生长较好，在氮源为尿素时菌丝生长缓慢。其中氮源为酵母浸粉和蛋白胨时，菌株BJM-11的菌落直径较大，二者差异不显著，但均显著大于其他氮源处理。从图5-B可看出，菌株BJM-11在供试的11种氮源培养基上均能产孢，适合产孢的氮源为钼酸铵、硝酸铵、亮氨酸、酵母浸粉、硝酸钾、胰蛋白胨、脯氨酸、蛋白胨和牛肉膏，不适合产孢的氮源为尿素和甲硫氨酸。其中氮源为蛋白胨时，菌株BJM-11的产孢量最大，且显著大于其他氮源处理。

综上所述，以酵母浸粉或蛋白胨为氮源较适宜菌株BJM-11菌丝生长，以蛋白胨为氮源较适宜菌株BJM-11产孢。

2.6 不同培养基对菌株BJM-11菌丝生长和产孢的影响结果

从图6-A可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA 5种培养基上均能生长。其中培养基为PDA和PSA时，菌株BJM-11的菌落直径较大，二者差异不显著，但均显著大于其他培养基处理。从图6-B可看出，菌株BJM-11在PDA、PSA、CMA、查氏和NA 5种培养基上均能产孢。其中培养基为PDA时，菌株BJM-11的产孢量最大，且显著大于其他培养基处理。

综上所述，以PDA或PSA为培养基较适宜菌株BJM-11菌丝生长，以PDA为培养基较适宜菌株BJM-11产孢。

3 讨 论

内生真菌是定殖于宿主植物组织、但不引起宿主植物产生明显病变的一类真菌[18]，其在植物体内生长定殖是共同进化选择的结果，在进化过程中二者形成了互惠共生关系，使内生真菌产生与植物相同或相似的次级代谢产物[18-19]。这些次级代谢产物主要是抗生素类和水解酶类物质，能促进作物生长并抑制病原菌生长[20]。自Stierle等[21]从药用植物红豆杉韧皮部分离到1株能产紫杉醇的内生真菌后，学者们才探索将内生真菌尤其是药用植物内生真菌作为新型药用活性成分的重要潜在原料[22]，此后对药用真菌内生真菌的研究应用迅速成为热点，但针对生姜内生真菌的相关研究仅见Anisha等[23-25]从生姜中分离筛选到3株对生姜茎腐病菌具有明显拮抗活性内生真菌Rhizopycnisvagum、Paraconiothyriumsp.和Acremoniumsp.及Ginting等[26]从生姜中分离筛选到3株对尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum并分别鉴定为Curvulariaaffinis、Fusariumsolani和Glomerellacingulata的报道。

木霉菌是防治作物土传病害的重要拮抗真菌，种类繁多，不同种及同种不同菌株在生态学特性等方面存在明显差异[27-30]。本研究中，菌株BJM-11喜偏酸环境条件，在25～30 ℃及光照条件下其菌丝生长量和产孢量均较大，与刘连妹[31]、纪明山[32]对绿色木霉菌株的研究结果相似。本研究发现，菌株BJM-11的生态学特性也与其他报道[31-32]存在差异，如对温度的适应范围较窄，35 ℃时菌丝生长缓慢且完全不能产孢，可能与其宿主生姜生长喜阴凉不耐高温有关。在利用碳源方面，菌株BJM-11在碳源为葡萄糖时的营养生长较佳，与绿色木霉HT-01[31]和TR-8[32]的特性相似，但菌株BJM-11以甘露醇为碳源时产孢量最大，与绿色木霉HT-01[31]和TR-8[32]产孢的最佳碳源为葡萄糖不一致。在氮源利用方面，菌株BJM-11在氮源为蛋白胨时营养生长和产孢状况较好，其次为亮氨酸，与绿色木霉TR-8[32]营养生长和产孢的最适氮源为天门冬酰胺、亮氨酸不利于产孢的特性不一致；尿素不利于菌株BJM-11生长和产孢，与绿色木霉TR-8[32]对氮源利用特性一致。综合分析认为，在发酵培养基中碳源为葡萄糖或可溶性淀粉、氮源为酵母浸粉或蛋白胨时菌株BJM-11菌丝生长速度较快，在碳源为甘露醇、氮源为蛋白胨时菌株BJM-11产孢量较大，可用于指导其发酵生产。

目前关于菌株BJM-11对生姜的促生作用及相互作用的机理还不清楚，有待深入探究。

4 结 论

菌株BJM-11在温度25～30 ℃、pH 5.0～6.0、连续黑暗及以葡萄糖或可溶性淀粉为碳源、以蛋白胨或酵母浸粉为氮源、培养基为PDA或PSA条件下菌丝生长状况较佳，在温度25～30 ℃、pH 5.0～7.0、连续光照及以甘露醇为碳源、以蛋白胨为氮源、培养基为PDA条件下产孢量较大，可供开发利用BJM-11菌株参考。