陈 章，王强锋，陈 强，刘轶豪，张凌子

( 1. 四川省农业科学院农业信息与农村经济研究所，四川 成都 610066; 2. 四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610066; 3. 四川农业大学资源学院，四川 温江 611130)

【研究意义】丹参(SalviamiltiorrhizaBge)为多年生草本唇形科鼠尾草属植物，以根入药，对心血管系统疾病疗效显著，是四川的主要道地中药材[1]。近年来，随着中医药大健康产业的发展，丹参人工栽培面积快速扩大，但连作障碍却成为制约优质丹参生产的重要因素，因此亟需解决连作难题，促进丹参产业可持续健康发展。【前人研究进展】王刚云和李先恩等[2-3]研究表明，大部分丹参连作障碍的发生与多种病原菌有关，且属于土传病害。近年来对丹参的研究，主要集中于丹参栽培，包括种植方式与密度[4]、生防菌剂应用与丹参品质[5-7]，连作土壤浸提物变化[8-9]，以及丹参轮作[10-11]和丹参不同连作年限的土壤微生物变化[12-14]等方面。目前仅有少许研究丹参连作过程中正常生长丹参根际与非根际土壤、患病丹参根际与非根际土壤真菌类群差异[12]，但细菌类群变化未见报道。【本研究切入点】本论文采用可培养技术和PCR-DGGE技术，开展丹参GMP基地连作土壤细菌群落特征研究，旨在弄清楚丹参连作根际和非根际土壤细菌群落变化，为进一步解决丹参连作障碍提供依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品的采集

采样点在四川省中江县石泉乡GMP丹参种植基地，土壤类型为石灰性紫色土壤，土壤丹参连作8年。分别采集正常生长和患病丹参各10株连同植株与土壤一起装入无菌采样袋中带回实验室。按照患病丹参根际(HD1)和非根际(HD2)，正常生长丹参根际( CK1)和非根际(CK2)收集土样。

1.2 可培养细菌多样性

1.2.1 土壤细菌的分离 采用稀释涂布平板法[15]。将土壤制成10-1～10-7系列稀释悬液，取10-5、10-6、10-7梯度，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基平板表面涂布，37 ℃培养2～3 d，挑取单个菌落进行划线纯化，结合镜检获得供试细菌纯培养，牛肉膏蛋白胨培养基斜面保存4 ℃冰箱备用。

1.2.2 菌株DNA提取 将纯化的菌株接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28 ℃，150 r·min-1振荡培养8 h。将菌液转移至1.5 mL的EP管，4 ℃、10 000 r·min-1离心2 min，弃上清液，加入200 μl 1×TE缓冲液，再加入2 μl 20 mg·mL-1的溶菌酶和2 μl 10 mg·mL-1的蛋白酶K，37 ℃水浴1 h，后续步骤参照陈强等[16]的方法。

1.2.3 16S rDNA PCR-RFLP分析 16S rDNA序列扩增引物及反应体系参见文献[17]。PCR产物用4种限制性内切酶HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ在37 ℃(TaqⅠ在65 ℃)酶切8 h。酶切反应体系为10 μl，其中包括1 μl酶(10 U·μl-1)，1 μl 10×Buffer，1 μl BSA(1 mg·mL-1)，5 μl 16S rDNA的PCR产物和2 μl ddH2O。酶切产物用2 %的琼脂糖凝胶在80 V电压条件电泳分离2.5 h，使用凝胶成像系统拍照，图谱采用NTSYS软件，用非加权平均连锁法(UPGMA)进行聚类分析[12]。

1.2.4 16S rDNA序列测定及系统发育树构建 采用生物琼脂糖凝DNA胶回收试剂盒(EZ-10 Spin Column PAGE Gel DNA Extraction Kit)对已扩增的16S rDNA PCR产物进行纯化，纯化后送生基因测序公司测序。在NCBI中将菌株16S rDNA序列BLAST比对，取与之相似的菌株16S rDNA序列，用MEGA 5.1构建系统发育树[18]。

1.3 免培养细菌多样性

1.3.1 土壤总DNA提取 参见文献[12]，土样加入9 mL DNA 提取液混匀，再加入450 μl 溶菌酶(20 mg·mL-1)，37 ℃水浴30 min，其间摇动数次；然后加入50 μl蛋白酶K (10 mg·mL-1)，37 ℃水浴30 min，后续步骤参见Zhou 等[19]的方法进行。

1.3.2 PCR-DGGE 采用嵌套式PCR扩增，第一轮： 进行16S rDNA序列扩增[17]，然后用特异引物GC-F984/R1378扩增第二轮获得大约430 bp的片段用于DGGE分析[20]。

取20 μl第2轮PCR产物进行DGGE，采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突变检测系统，DGGE参数为：8 %聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度35 %～65 %，150 V电压下预电泳10 min，随后在85 V的固定电压，60 ℃下电泳11 h。电泳结束后银染[21]，条带克隆测序。

1.3.3 DGGE图谱分析 DGGE图谱采用Bio-rad的Quantity One分析软件进行微生物多样性分析[22]。

2 结果与分析

2.1 可培养细菌多样性

从供试丹参种植土壤共分离出46株细菌纯培养物，其中正常生长丹参根际土壤(CK1)17株，正常生长丹参非根际土壤(CK2)8株；患病丹参根际土壤(HD1)12株，患病丹参非根际土壤(HD2)9株。菌株编号ZJZG代表正常根际土壤(CK1)，ZJZF代表正常非根际土壤(CK2)，ZJHG代表患病根际土壤(HD1)，ZJHF代表患病非根际土壤(HD2)。从丹参根际土壤分离的可培养细菌高于非根际土壤，说明根系分泌物对土壤细菌有较大的影响。

提取土壤基因组DNA，1 %琼脂糖凝胶电泳分析，条带清晰、整齐，无拖尾现象，说明土壤DNA提取质量较高。以土壤细菌基因组DNA为模板扩增16S rDNA片段，获得1500 bp的特异性片段。酶切图谱进行聚类分析，在50 %的水平上，全部菌株聚在一起；在79 %相似水平处，全部供试菌株被分成分为7个遗传群(图1)，其中，ZJHF06，ZJHG09，ZJHF09 和ZJZF04分别单独成群；群Ⅰ由来源于4种土样的27个菌株组成； ZJHF08，ZJHG06，ZJHG07组成群Ⅲ； ZJZG06和ZJZG10组成群Ⅵ。从4种土壤中分离的细菌，既有细菌处于同一个遗传群，也有细菌构成特有的遗传群。

选取12个细菌为代表菌株，其16S rDNA构建的系统发育树形成了5个分支(图2)。分支1为芽孢杆菌属(Bacillus)，分支2为短杆菌属(Brevibacterium)，分支3为拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)，分支4为假单胞菌属(Pseudomonas)。可见，中江丹参连作土壤细菌主要类群为芽孢杆菌属细菌(Bacillus)。不同生长状态的丹参土壤，可培养细菌也表现出了差异，其中，短杆菌属和拜叶林克氏菌属出现在患病根际土壤；而假单胞菌属出现在丹参正常生长的根际和非根际土壤。

图1 细菌16S rDNA PCR-RFLP UPGMA 树状图Fig.1 UPGMA dendrogram generated from the positive bacteriaof 16S rDNA PCR-RFLP

2.2 免培养细菌多样性

2.2.1 土壤总DNA提取及16S rDNA扩增 土壤总DNA纯化后，经0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测，大于23 kb，条带清晰、整齐，无拖尾现象，质量较好。土壤总DNA经过巢式PCR，第一轮获得大小约1500 bp的16S rDNA片段，阴性对照无扩增条带，第二轮获得约430 bp的片段，与预期一致。

2.2.2 DGGE图谱分析 变性梯度凝胶电泳结果表明，不同样品间DGGE条带强度和迁移位置都有所不同(图3)。患病丹参根际土壤(HD1)与其他土壤的条带差异很大。其中，相比正常生长丹参根际土壤(CK1)，条带XB2，XB3，XB4，XB5为患病丹参根际土壤(HD1)所特有，而XA1，XD6，XD7为其它3种土样所特有，这说明患病丹参根际土壤细菌类群发生较大变化。

采用UPGMA对供试土壤DGGE图谱进行聚类(图4)，供试样品形成3个分支，CK1和CK2为1个分支，与患病丹参土壤样品HD1和HD2明显分离开。正常生长和患病丹参种植土壤，不同土壤样品的DGGE条带存在差异，说明丹参种植过程中，根际与非根际细菌类群发生了显著变化，尤其是患病丹参的根际和非根际差异极大，表明其细菌类群在连作过程中已经发生较大的变化。

图2 代表菌株的16S rDNA基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the representative isolates

图3 土壤细菌PCR-DGGE图谱Fig.3 PCR-DGGE profiles of the soil bacterial community

图4 土壤细菌DGGE条带图谱聚类分析Fig.4 Cluster analysis based on DGGE bands profiles

2.2.3 DGGE条带克隆测序分析 选取7个典型DGGE条带进行克隆测序，绝大多数条带为未培养细菌(Uncultured bacterium)，占所有条带的71.43 %；仅有2个条带为可培养菌，条带XB2代表了可培养的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，条带XB3代表了为可培养的坚强肠球菌(Enterococcusdurans)，其相似性达99 %(表1)。

表1 DGGE条带的序列相似性比对

3 讨 论

尽管传统的板分离技术只能获得环境微生物总数的0.1 % ～10.0 %[23]，不利于研究环境样品的微生物多样性，但稀释平板法可通过分离、纯化得到纯菌株，鉴定明确分类地位，这对于弄清不同种植方式对丹参土壤细菌群落的影响具有积极意义。本研究分离获得的46个菌株，虽然只分布在芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)和假单胞菌属(Pseudomonas)，但研究结果较好地揭示出了不同处理间细菌种群差异，且以芽孢杆菌为优势种群，这有助于进一步筛选促进丹参生长的有益菌株。

与此同时，应用PCR-DGGE免培养技术分析了土壤细菌群落，其结果显示，PCR-DGGE结果与纯培养结果完全不同，代表性条带大多为不可培养细菌，仅有2个条带代表了可培养的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，坚强肠球菌(Enterococcusdurans)，而这2个菌株未在纯培养物中出现。相关研究表明，植物在连作过程中，其根系分泌物和残落物亦会对根际微生物群落产生影响[26-27]。PCR-DGGE能较好地反映丹参患病土壤和正常土壤细菌类群的差异，尽管大多数条带都是未鉴定细菌(Uncultured bacterium)，这与林贵兵的研究相似[11]，也说明丹参连作障碍的发生机理极为复杂。

4 结 论

本研究表明，不同的丹参种植土壤样品间，既有分类地位相同的细菌种类存在，也有各自特有的细菌种群，这为进一步探明丹参连作障碍发生机理，进而控制连作障碍提供微生物学理论依据。