魏 然，肖玉红，徐维，曾 飞

(南昌大学第二附属医院普外科，南昌 330006)

结直肠癌是一种常见的人类恶性肿瘤，据统计每年有100万患者受到结直肠癌的影响。在我国，结直肠癌在癌症相关死因中已跃居第3位，成为男性第三大常见肿瘤和女性第二大常见肿瘤[1]。结直肠癌早期不易诊断，往往直至手术时才发现多数肿瘤已经穿过浆膜，且多有淋巴结转移，这为结直肠腺癌的治疗增加了难度[2]。影响结直肠癌的侵袭和迁移的原因及影响因素较多[3]。有研究表明，细胞外基质(ECM)的被动酶解是结直肠癌侵袭、迁移过程中的重要环节。其中，基质金属蛋白酶类(MMPs)是参与破坏细胞外基质的一种重要的蛋白水解酶，尤其是MMP-9，其表达产物在癌细胞侵袭、迁移过程中能使基底膜的主要成分Ⅳ型胶原酶解，还可以酶解细胞间基质成分[4-7]。MARSHALL等[8]经研究发现，MMP-9的选择性抑制剂可减慢原位移植结直肠癌模型小鼠肿瘤细胞的生长速度，降低肿瘤转移率。目前有研究提示，人参皂苷Rh1对人肝癌、恶性胶质瘤的发生、发展产生影响，并可以抑制肿瘤的侵袭和迁移[9-10]。而人参皂苷Rh1是通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白的磷酸化和转录，从而激活活化蛋白-1(AP-1)，进而抑制了MMP-9及其他MMP蛋白的表达。同时有研究证明，人参皂苷Rh1抑制MAPK信号通路的方式不完全相同，这种差异可能来自肿瘤细胞本身的影响，但是都可以在转录水平抑制AP-1[10-11]。本研究的目的是探究人参皂苷Rh1对人结肠癌细胞SW480侵袭和迁移的影响，初步探索其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 从中国科学院上海生科院细胞资源中心购得人结肠癌细胞株SW480。人参皂苷Rh1浓度为98.76%，购自海永恒生物科技有限公司；佛波酯(PMA)购自Gibcol公司；ELISA检测试剂盒购自Sigma公司；双抗购自Cellsignal公司；Transwell BD胶购自Osmonic公司；Western blot及提取蛋白质的相关试剂材料购自上海锐赛生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1实验分组 将细胞分为对照组，50 ng/mL PMA处理组，30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组，100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组，300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组。

1.2.2细胞划痕实验 SW480细胞在普通培养瓶中培养换液，当细胞浓度达到80%时，用胰蛋白酶消化并计数。调整细胞浓度为5×105/mL，按照细胞1×106/孔的密度接种于6孔板中，6孔板底部用黑色标记笔做好标记线，每孔3条平行线，间距0.5 cm左右。按在37 ℃及5%CO2条件下孵育，24 h后细胞面积至少达到90%。第2天，用高压灭菌100 μL黄枪头垂直且快速地进行细胞划痕，与标记线垂直划出3条线，建立损伤模型。后用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，除去划下的细胞。板上6个孔分为 6组，每孔分别加入含或不含PMA和人参皂苷Rh1(0、30、100、300 μmol/L)无血清培养基(人参皂苷Rh1预先处理细胞1 h，PMA后处理)，继续孵育。此后通过光学显微镜每24小时记录细胞划痕进程。无菌PBS洗涤2次，光学显微镜低倍(×10)观察并拍照，每孔选取4个划痕区视野拍摄划痕宽度，应用Image-Pro plus6.0软件进行处理，划痕宽度=测量空隙的面积/长度。

1.2.3细胞侵袭实验(Transwell小室法) 使用Boyden室(Millicell Millipore，美国)评估细胞侵袭和迁移。实验前无血清DMEM培养基(不含双抗)、Transwell小室、24孔板、枪头等实验用品放入-20 ℃冰箱过夜进行预冷，将小量分装好的Matrigel胶从-20 ℃冰箱移入4 ℃冰箱进行解冻。(1)包被基底膜：冰浴操作，将丙酸倍氯米松(BD)胶用基础培养基1∶8稀释。均匀铺开且不能产生气泡。每孔50 μL Matrigel注入Transwell小室中,37 ℃孵育Transwell孔板4～5 h。(2)水化基底膜：用1×PBS轻轻润洗1～2次，去掉未凝的胶。贴壁SW480细胞与各组DMEM完全培养基作用48 h后(人参皂苷Rh1预先处理细胞1 h，PMA后处理),制备SW480细胞悬液，即胰酶消化将细胞分散成单个制备细胞悬液，离心1 000 r/min 5 min，用无血清DMEM培养液重悬1次细胞，除去培养基中的血清，调整细胞密度至5×105/mL。往已包被好BD凝胶的上室加入200 μL无血清培养基细胞重悬液，下层的培养液中加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM培养基(含500 μL肿瘤细胞趋化因子)。将接种完毕的24孔板移入 37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养48 h。孵育结束后用棉签擦去上室未穿过的细胞。将小室下端提起，浸润于95%乙醇中固定10 min。0.1%结晶紫染液染色10 min，清洗掉多余染液，室温晾干后拍照记录。计数每孔中6 个不同视野，计数穿膜细胞数，取平均数以评估细胞的侵袭能力。每组设3个重复孔。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MMP-9蛋白水平 取生长良好的对数期SW480细胞，常规胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞浓度为1×105/mL，每孔150 μL接种于96孔板，每组设3个复孔，孵箱孵育24 h。移液管吸净培养基，加入各组无血清DMEM培养基，24 h后终止培养，用0.22 μmol/L孔径的滤过膜过滤培养基上清液，以除去悬浮的死细胞及部分代谢物，离心使上清液浓缩25倍，根据MMP-9 ELISA试剂盒说明书检测其中MMP-9的蛋白水平，最小检出量为7.3 pg/mL。

1.2.5Western blot检测MMP-9蛋白表达灰度值 细胞处理同ELISA，待SW480生长至90%，消化离心后，再清洗1次后离心，提取沉积物。用中等细胞裂解液和PMSF 100∶1，冰上裂解提取细胞的总蛋白，使用BCA蛋白质分析盒确定蛋白水平。蛋白以10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳，再将蛋白转到硝酸纤维素(PVDF)膜上。常规5%脱脂牛奶封闭，TBST 3次5 min洗膜后，加一抗4 ℃孵育过夜。后继续TBST洗膜，加入对应抗兔二抗室温孵育1 h。二抗孵育结束后，用ECL法显色，X射线曝光条带，洗膜。用ImageJ检测蛋白表达灰度值。

2 结 果

2.1划痕愈合实验 30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、300μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组的SW480细胞的迁移距离比分别为50 ng/mL PMA处理组的(0.76±0.03)、(0.60±0.04)、(0.29±0.08)倍(P<0.05)，见图1。

2.2细胞侵袭实验 对照组、50 ng/mL PMA处理组、30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组细胞穿过基质胶的数量分别为261.6±29.7、729.7±36.5、581.7±49.9、359.0±34.4、265.0±34.1。对照组与300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组比较差异无统计意义(P=0.907)，其余组两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A：对照组划痕愈合实验； B：50 ng/mL PMA处理组划痕愈合实验； C：30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组划痕愈合实验； D：100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL处理组划痕愈合实验；E：300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组划痕愈合实验；F：各组细胞迁移能力柱状图。1：对照组；2：50 ng/mL PMA处理组；3：30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组；4：100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL处理组；5：300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组

图1 人参皂苷Rh1抑制人结肠癌SW480细胞的迁移能力(×100)

A：对照组细胞侵袭实验； B：50 ng/mL PMA处理组细胞侵袭实验； C：30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组细胞侵袭实验； D：100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL处理组细胞侵袭实验；E：300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组细胞侵袭实验；F：各组细胞迁移能力柱状图。1：对照组；2：50 ng/mL PMA处理组；3：30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组；4：100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL处理组；5：300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组

图2 人参皂苷Rh1抑制人结肠癌SW480细胞的侵袭能力(姬姆萨染色，×100)

1：对照组；2：50 ng/mL PMA处理组；3：30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组；4：100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL处理组；5：300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组

图3 ELISA检测细胞培养上清液中的MMP-9蛋白水平

2.3ELISA检测MMP-9蛋白水平 对照组、50 ng/mL PMA处理组、30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组细胞培养液中MMP-9蛋白水平分别为(86.67±8.80)、(293.33±31.02)、(196.00±41.51)、(166.33±30.14)、(110.33±26.50) pg/mL。对照组与300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组比较差异无统计意义(P=0.350)。其余组两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.4Western blot检测结肠癌细胞MMP-9的蛋白表达水平 30 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、100 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组、300 μmol/L人参皂苷Rh1+50 ng/mL PMA处理组的MMP-9蛋白表达分别为50 ng/mL PMA处理组的(0.80±0.04)、(0.47±0.03)、(0.06±0.00)倍(P<0.05)，见图4。

图4 Western blot检测结肠癌细胞MMP-9的蛋白表达水平

3 讨 论

近年来，越来越多的研究团队开始研究人参皂苷Rh1在肿瘤治疗中的作用。孙倩[12]研究发现人参皂苷Rh1在人宫颈癌Hela细胞系及白血病K56细胞中发挥了重要的作用，可以抑制B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的表达及促进Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达增强，进而促进肿瘤细胞的凋亡，同时其作用和药物浓度有密切的关系。CHOI等[11]证明人参皂苷Rh1可以在人单核白血病细胞中通过抑制细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)1/2，JNK和p38 MAPK的磷酸化进而抑制MAPK信号通路，从而抑制肿瘤的侵袭迁移。YOON等[9]证明人参皂苷Rh1可以抑制AP-1二聚体C-fos和C-Jun的表达，而AP-1被认为在MMP启动子转录激活中起主导作用，因而人参皂苷Rh1可以下调MMP-1的表达，进而抑制肝癌细胞侵袭转移。JUNG等[10]发现，人参皂苷Rh1可以抑制MAPK和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(P13K/Akt)信号通路和下游的转录因子核因子κB(NF-κB)、AP-1的活性及表达，进而下调MMP-1、MMP-3、MMP-9，从而抑制人恶性胶质瘤细胞侵袭转移。

MMP的表达水平与结肠癌分期及预后密切相关，然而大部分MMP抑制剂因为不良反应大导致作用效果欠佳。因此，研发新的、不良反应小的MMP选择性抑制剂用于结肠癌临床治疗具有重要意义。有一些天然药物表现出MMP抑制特性。芒果苷就是通过PI3K/AKt和MAPK通路，抑制转录因子AP-1、NF-κB与MMP-9的结合，从而抑制MMP-9基因的表达[13]。另外青蒿素等也能抑制MMPs的表达，此类天然药物具有毒副作用少、毒性低的特点[14]。本实验利用Transwell小室内Matrigel胶重建基底膜实验研究人参皂苷Rh1对SW480细胞侵袭能力的影响。结果表明，PMA能显著地促进肿瘤细胞侵袭，当Rh1水平为30 μmol/L时发挥拮抗PMA的作用，并呈浓度依赖性，在人参皂苷Rh1浓度为300 μmol/L时，可以基本上抑制PMA促肿瘤侵袭的作用。细胞侵袭的数量随药物浓度的增加明显降低，因此说明Rh1能明显抑制SW480细胞的突破基底膜、胞外基质的能力。基底膜是肿瘤细胞侵袭转移的第一道屏障的重要部分，当肿瘤细胞发生侵袭时，通过膜表面受体与基底膜成分进行黏附,然后释放并激活蛋白酶降解基底膜，定向运动穿越基底膜形成的缺损部位。人参皂苷Rh1可抑制SW480细胞突破基底膜的能力，降低发生远处转移的概率。本研究使用细胞划痕模拟这一环节，实验结果显示PMA能促进SW480细胞迁移，30 μmol/L Rh1开始拮抗PMA的作用，并呈浓度依赖性，在人参皂苷Rh1浓度为300 μmol/L时，PMA促肿瘤侵袭作用基本上完全被抑制。因此Rh1可以有效降低SW480细胞的运动能力而降低远处转移的风险。本实验采用ELISA、Western blot检测各组细胞内、外MMP-9蛋白表达，结果显示，50 ng/mL PMA组MMP-9蛋白表达量明显提高，当人参皂苷Rh1浓度为30 μmol/L时，MMP-9蛋白表达量较50 μmol/L PMA组明显下降。本研究结果进一步说明了人参皂苷Rh1在结肠癌细胞侵袭和转移中发挥了重要作用，作用机制可能是抑制了MMP-9的表达，但其更为详细的作用机制还不清楚，因此，人参皂苷Rh1在结肠癌细胞侵袭和转移的作用机制还需进一步研究。