袁琳，张建洁，陈雪，郑艳，姚燕，李平

（1.华北石油管理局总医院 1.妇科，2.耳鼻喉科，河北 任丘 062552）

子宫内膜异位症（Endometriosis,EMS）是指子宫内膜组织（腺体和间质）在子宫腔被覆内膜以外的部位生长、浸润的一种慢性妇科疾病[1]。流行病学资料显示，约5%～10%育龄妇女患子宫内膜异位症，其中50%患者存在生育问题[2]。EMS 的诊断主要凭借腹腔镜检查，但其具有高侵入性且在EMS 晚期发挥作用。超声及其他成像技术在EMS 的诊断和分期方面准确性不高[3]。目前缺乏高效的EMS 早期血清诊断标志物。虽然一些EMS 患者的血清CA-125 升高，但并不是特异性的，而且敏感性也较差。因此，寻找一种非侵入性的，高效的EMS 早期诊断标志物显得尤为重要。microRNAs（miRNAs）是一种小的，具有21 ～22 个核苷酸的非编码RNA 分子。miRNAs 通过基因沉默在转录后的水平或催化转录本降解，调控许多生物过程[4]。 由于成熟的miRNAs 能够与蛋白复合物结合，所以miRNAs 既存在于细胞内，也稳定存在于血清中，这使其成为具有诊断各种疾病的生物标志物的潜力[5-6]。另外，血清miRNAs 表达稳定，重复性好，个体间差异小，其特异性表达模式已被认定为包括癌症在内的多种疾病的生物标志物[7]。血液中miRNA 水平的改变可能反映正常生理过程中的变化[8-9]，并与一些病理条件有关，如妇科一些常见疾病[10-11]。在与EMS 密切相关的失调miRNAs 中，miR-122-5p 与miR-199a-5p 在EMS 患 者的血清中表达增强，且与疾病病理分期呈正相关，两者的血清浓度也呈正相关。同时，两者的靶基因均为凋亡相关的，在子宫内膜癌的分化中发挥重要作用的基因SOX4，故两者联合诊断EMS 具有很好的前景[12]。 此外，EMS 的炎症标志物还存在争议，有研究证实，EMS 与健康女性的白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）水平比较无差异，而另有研究表明，EMS 患者的IL-6 水平较高[13]。故本研究将评估血清miR-122-5p、miR-199a-5p 及IL-6 在EMS 早期诊断中的价值及临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究是一项前瞻性研究，随机选取2016年 1月—2017年12月华北石油管理局总医院诊治的EMS 患者90 例（EMS 组）及同期盆腔疼痛或不孕症检查的患者70 例（对照组）为研究对象。其中EMS患者均经腹腔镜诊断，组织病理学检查证实。根据经修订的美国生殖医学分类学会，EMS 被分为轻度/轻度（Ⅰ、Ⅱ期）或中度/重度（Ⅲ、Ⅳ期）[14]。对照组包括所有接受腹腔镜手术治疗盆腔疼痛、不孕症或良性肿瘤，但未被诊断为EMS 的妇女。排除标准：①腹腔镜前3 个月内接受药物治疗；子宫腺肌症、子宫内膜癌/增生、子宫内膜息肉。②慢性或急性炎症性疾病、感染性疾病、恶性肿瘤。③身免疫性疾病和心血管疾病。研究内容和方法均经受试者知情并签署同意书，且经本院医学伦理委员会批准。

1.2 样本采集及检测方法

所有受试者于术前清晨空腹抽静脉血，3 000 r/min离心15 min，分离出血清后于-80℃冰箱冷冻保存备用。Thermo Fisher miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒、Thermo Fisher qPCR Super Mix 试剂盒均购自美国Thermo Fisher 生物技术有限公司，引物由美国Invotrigen 公司设计并合成，酶联免疫吸附试验检测IL-6 的浓度，由深圳欣博生物科技有限公司提供。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检 测miR-122-5p 和miR-199a-5p 的 表 达（SYBRGreen 法）。U6 RNA 作为内参。逆转录的cDNA 保存在4℃。实时聚合酶链反应（real-time PCR）反应体系：10 μl cDNA，12.5 μl SYBR Green Master Mix，0.5 μmol/L 引物，RNase-free 水补充体积至25 μl。Real-time PCR 检测采用7500 real-time PCR System（美国Applied Biosystems 公司）。反应条件：95℃预变性 5 min，95℃变性10 s，57℃退火30 s，75℃延伸30 s，共35 个循环。检测miRNA 的相对表达水平，以U6 为内参基因，对目标基因进行归一化处理。血清中miRNA 的相对表达水平计算公式如下：RQ=2-ΔΔCt。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验，Pearson 进行相关性分析，ROC 曲线分析血清miR-122-5p 和miR-199a-5p的最佳截断水平，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料比较

两组患者年龄、体重指数（BMI）、临床症状比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；生育史比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 一般临床资料比较

2.2 两组患者血清IL-6 水平及miR-122-5p、miR-199a-5p 的表达

EMS 组患者的血清IL-6 水平及miR-122-5p 与miR-199a-5p 的表达与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），EMS 组患者增高。见表2和图1。

2.3 血清miR-122-5p 与miR-199a-5p 的表达与EMS 患者的临床病理特征关系

不同病理分期的EMS 患者中，血清miR-122-5p与miR-199a-5p 的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 两组患者血清IL-6 水平及miR-122-5p 与 miR-199a-5p 的表达 （±s）

表2 两组患者血清IL-6 水平及miR-122-5p 与 miR-199a-5p 的表达 （±s）

组别 n IL-6/（pg/ml） miR-122-5p miR-199a-5p EMS 组 90 51.67±12.11 4.23±0.82 4.59±1.01对照组 70 17.92±10.17 1.65±0.33 1.17±0.22 t 值 18.741 24.826 27.863 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 EMS 患 者 血清IL-6 水 平、miR-122-5p、miR-199a-5p 表达的相关性

EMS 患者血清IL-6 水平、miR-122-5p、miR-199a-5p 的表达呈正相关。见表4。

2.5 EMS 患者血清miR-122-5p 和miR-199a-5p表达的诊断效率

表3 血清miR-122-5p 与miR-199a-5p 的表达与 EMS 患者的临床病理特征关系 （±s）

表3 血清miR-122-5p 与miR-199a-5p 的表达与 EMS 患者的临床病理特征关系 （±s）

病理分期 n miR-122-5p miR-199a-5pⅠ、Ⅱ 38 4.31±0.68 4.98±1.23Ⅲ、Ⅳ 52 4.26±0.17 5.06±1.07 t 值 0.453 0.325 P 值 0.651 0.746

图1 两组患者血清miR-122-5p 与miR-199a-5p 的表达水平 （±s）

表4 EMS 患者血清IL-6 水平、miR-122-5p、miR-199a-5p 表达的相关性

EMS患者血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 表达的诊断效率以ROC 曲线下面积（AUC）表示。见表5和图2。

表5 EMS 患者血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 表达的诊断效率

图2 EMS 患者血清miR-122-5p 与miR-199a-5p 表达的ROC 曲线

3 讨论

目前，EMS 的诊断和评估主要凭借腹腔镜，但由于腹腔镜技术具有高侵袭性，且诊断的EMS 大多数处于疾病晚期，故开发用于EMS 早期阶段的敏感性及特异性高的生物标志物显得尤为迫切。本研究中，EMS患者的血清miR-122-5p、miR-199a-5p 及IL-6 的水平升高，血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 用于检测EMS 的敏感性分别为94.7%和92.1%，特异性分别为90.5%和88.6%，提示这些分子有可能成为诊断EMS生物标志物的潜力。此外，相关性分析得出，miR-122-5p 的表达与IL-6、miR-199a-5p 表达呈正相关，这说明miRNAs 联合炎症因子检测EMS 具有较高的诊断准确率。

miRNAs 在多种生理和病理条件下起着重要的作用。在各种类型的癌症中，包括实体瘤、白血病、B细胞淋巴瘤、卵巢癌和其他疾病，如糖尿病和肝硬化，均检测到血浆miRNAs 的变化[15]。由于血清标志物的获取方便，测量方法简单可行。因此，其在早期诊断EMS 具有很好的应用前景。然而，先前的研究主要集中在子宫内膜组织中miRNAs 的表达。LIU 等[16]通过TCGA 数据库分析子宫内膜腺癌组织中表达异常的mRNA，miRNA 与DNA 甲基化相关基因，最终确定出异常变化的DEGs，包括ZEB1、ZEB2、TIMP2、TCF4、CYP1B1、PITX1、PITX2、ZNF154 及TSPYL5等有望成为治疗子宫内膜腺癌的靶点。循环miRNAs用于早期诊断EMS 的研究是一个新的领域，相关的研究报道较少[17]。WANG 等[18]对子宫内膜异位症和健康女性患者的血清miRNA 表达的研究表明，miR-122和miR-199a 的水平升高，miR-145、miR-141、miR-542-3p 及miR-9 在EMS 患者中的水平降低，并提出该化合物可以作为其潜在的生物标志物。同时，研究还指出miR-122a 和miR-199a 的表达可能用于评估疾病的严重程度。本研究结果提示，miR-122a 和miR-199a 的表达与疾病的严重程度无相关性。还需要进一步扩大样本量，多中心进行研究。WANG 等[18]对30 例轻度子宫内膜异位症患者和20 例对照组女性血清样本的miRNAs 表达进行评估。通过深度测序，发现有98 个miRNAs 被下调，10 个miRNAs 被上调。这可能是由于抽样技术和分析方法的不同造成[19]。

综上所述，与对照组比较，子宫内膜异位症患者的血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 的水平升高，且诊断效率较高。因此，这些miRNAs 有望成为诊断子宫内膜异位症生物标志物的潜力。此外，本研究还存在缺乏腹腔镜检查EMS 后患者的用于评估该miRNAs 稳定性的随访资料，后续深入研究为血清miR-122-5p 和miR-199a-5p 成为EMS 诊断标志物提供证据。