杨飞

摘 要：目的：建立杏香兔耳风中熊果苷和对苯二酚含量测定方法。方法：采用HPLC法，以甲醇-0.4%磷酸水为流动相，流速0.65mL/min，等度洗脱，检测波长为286nm。结果：熊果苷进样量在0.35μg～3.5μg范围内呈线性关系（r=1.0000，n=6），平均回收率为99.75%；对苯二酚进样量在0.025μg～0.25μg范围内呈线性关系（r=1.0000，n=6），平均回收率为98.04%。结论：建立HPLC法同时测定杏香兔耳风中熊果苷和对苯二酚的含量，为控制药材质量提供方法。

关键词：杏香兔耳风；熊果苷；对苯二酚；HPLC

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）05-0199-02

杏香兔耳风（Ainsliaea fragrans Champ.）为菊科兔耳风属植物干燥全草，分布于长江流域及南方各省[1]，具有清热、利湿、凉血、解毒功效，治疗感冒咳喘、咽喉痛、肠炎、痢疾、泌尿疾病等症[2-3]。药理学研究表明，该属植物具有抗菌、止血、保肝、细胞毒作用等[4-5]。化学成分主要有酚酸类、黄酮类和萜类等[6]。

杏香兔耳风含量测定的研究报道较多，多以木犀草素、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸[7]等指标成分进行含量测定，尚未见熊果苷或对苯二酚等指标成分进行含量测定报道。本文选择熊果苷和对苯二酚作为指标成分，采用高效液相色谱法同时测定其含量，为控制药材质量提供可靠方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪（日本岛津）：LC-20AT液相色谱输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱数据处理系统；KQ-500DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，江苏）；TGL-16型高速离心机（江苏金坛市中大仪器厂）；AB135-S型十万级电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士）。

1.2 植物与试剂

杏香兔耳风于2013年6月采于贵州贵阳市，由河南大学李昌勤教授鉴定为菊科兔耳风属植物杏香兔耳风Ainsliaea fragrans Champ。

熊果苷对照品（纯度：HPLC≥98%，成都普菲德生物技术有限公司，批号：120715，供含量测定用）；对苯二酚对照品（纯度：GC>99%，德国默克股份两合公司，供含量测定用）；甲醇（色谱纯）；水为纯净水（杭州娃哈哈百利食品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称取熊果苷对照品和对苯二酚对照品分别为3.5mg和0.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.35mg/mL熊果苷和0.025mg/mL对苯二酚混合对照品储备液。

1.3.2 供试品溶液的制备

取杏香兔耳风粉末（过70目筛）4.00g，置于100mL锥心瓶中，精密加甲醇（分析纯）50mL，超声（功率300W，频率40kHz）30min，用甲醇补足减失的重量，即得。

1.3.3 色谱条件[8～9]

色谱柱：PurospherstarRP-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸水（30：70）流速：0.65mL/min；柱温：室温；检测波长：286nm；进样量：4μL。熊果苷对照品和对苯二酚对照品及供试品的HPLC图见图1。

1.3.4 线性关系的考察

精密吸取2.1项下的熊果苷和对苯二酚混合对照品溶液，按杏香兔耳风色谱条件，分别依次进样1、2、4、6、8和10μL，记录各组分峰面积。

1.3.5 精密度实验

精密吸取2.1项下的熊果苷和对苯二酚混合对照品储备液4μL注入液相色谱仪，连续进样6次，测得熊果苷和对苯二酚的峰面积。

1.3.6 稳定性实验

精密吸取杏香兔耳风样品5μL，按上述杏香兔耳风供试品溶液方法进样，分别在0、3、6、9、12和24h依法测定，测得熊果苷和对苯二酚的峰面積。

1.3.7 重复性实验

精密称取杏香兔耳风样品6份，按上述供试品制备方法制成供试品溶液，按上述杏香兔耳风色谱条件进样5μL，测定熊果苷和对苯二酚的峰面积。

1.3.8 加样回收率试验

称取已知熊果苷和对苯二酚含量的杏香兔耳风粉末（过70目筛）6份，每份为400mg，加入一定量的标准品，按供试品溶液制备项下方法制备溶液，按上述色谱条件进样5μL，记录峰面积值。

1.3.9 样品处理

（1）杏香兔耳风水提醇沉物。取杏香兔耳风粉末约50.00g，置于1000mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水500mL，加热回流提取2h，抽滤得滤液，将滤渣加蒸馏水400mL，再加热回流提取1h，将滤液稍浓缩后加95%乙醇使醇含量达到70%，醇沉，上清液浓缩，即得水提醇沉物。

（2）杏香兔耳风乙醇/乙酸乙酯提取物。取杏香兔耳风粉末50.00g，置于1000mL圆底烧瓶中，加入乙醇/乙酸乙酯500mL，加热回流提取2h，抽滤得滤液，将滤渣再加相应溶剂400mL，再加热回流提取1h，合并两次滤液，浓缩，即得相应溶剂的提取物。

（3）杏香兔耳风甲醇提取物。取上述乙酸乙酯第二次加热回流后的滤渣置于1000mL圆底烧瓶中，加入甲醇500mL，加热回流提取2h，抽滤得滤液，将滤渣再加甲醇400mL，加热回流提取1h，合并两次滤液，浓缩，即得相应溶剂的提取物。

（4）样品高效液相色谱法。精密称取浸膏，用甲醇（色谱纯）溶解制成供试品溶液，按上述杏香兔耳风色谱条件均进样4μL，测定熊果苷和对苯二酚的峰面积。

2 结果

2.1 线性关系的考察

以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标做标准曲线，熊果苷的回归方程为Y=668115.01X+ 5579.18，r=1.0000，线性范围：0.35～3.5μg；对苯二酚的回归方程为Y=1E+06X+143.22，r=1.0000，线性范围：0.025 ～0.25μg。

2.2 精密度实验

峰面积结果计算RSD分别为0.30%和0.99%，结果表明仪器的精密度良好。

2.3 稳定性实验

峰面积结果计算RSD分别为0.78%和1.87%，结果表明供试品中熊果苷和对苯二酚在24h内基本稳定。

2.4 重复性实验

峰面积结果计算RSD分别为1.31%和2.05%，结果表明本实验重现性好。

2.5 加样回收率实验

记录峰面积值，由回归方程計算含量，按下式计算加样回收率，结果见表1和表2。

回收率%=（测得总量-样品中含量）/加入对照品量×100%

2.6 样品含量测定

记录样品峰面积值，根据回归方程算出样品中熊果苷和对苯二酚含量，最后得出相应的百分含量。结果如表3。

3 讨论

分别考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水以及不同比例流动相，最终选定效果较好的甲醇-0.4%磷酸水（30：70），分离效果好，峰形对称，拖尾因子最小。当较小的改变流动相比例时，会使熊果苷和对苯二酚拖尾因子变大。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].第79卷.北京：科学出版社，1996.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] ZHOU YB， HE SZ. Species and distribution of Ainsliaea medicinal plants in Guizhou[J]. China J Chin Mater Med，1998，23（7）：389.

[4] 李桂兰，芮成.3种杏香兔耳风提取物抑菌活性的研究[J].中国医药指南，2010，8（7）：45-47.

[5] 崔雪靖.复方半边莲和复方杏香兔耳风保肝活性研究[D].河南大学，2014.

[6] 邢春秀，谢宁，杨念云，等.杏香兔耳风的化学成分[J].江苏药学与临床研究，2006，14（2）：39.

[7] 邬浩杰，邹盛勤.HPLC法测定不同产地杏香兔耳风中绿原酸和木犀草素的含量[J].中国药师，2014，17（6）：929-931.