陈 娜 周中银

(武汉大学人民医院消化内科，消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：614220735@qq.com)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因和发病机制尚不十分明确的慢性非特异性炎症性肠病，病变主要累及直肠、乙状结肠的黏膜层和黏膜下层，其发作期与缓解期交替出现，临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等症状[1-2]。主流观点认为肠腔上皮屏障结构的破坏使得肠道菌群失调，引起免疫细胞的激活和细胞因子的产生，继而导致肠道炎症反应,其中辅助性T细胞(T helper cell，Th)1和Th2亚群的平衡失调是UC的发病机制之一[3-4]。咪唑喹啉胺类药物咪喹莫特是一种Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)7激动剂，属于小分子免疫调节剂。咪喹莫特可以激发抗原提呈细胞,诱发树突状细胞分泌多种细胞因子以及表达多种共刺激分子，进而活化机体的天然与获得性免疫来发挥作用[5]。目前，咪喹莫特在临床上尤其是皮肤科应用广泛，并且取得较好的疗效[6]。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ )技术是一种同位素标记的蛋白质组学定量技术，可以对多达8种不同样本进行蛋白定量分析，具有较好的精确性和重复性，在蛋白质组学研究中应用广泛[7-8]。本研究利用iTRAQ蛋白质组学技术，通过分析咪喹莫特对UC小鼠结肠组织蛋白表达的影响，探讨咪喹莫特治疗UC的作用机制，为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 野生型SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，6～8周龄，体重18～20 g，购买于北京维通利华实验动物研究中心，均饲养于武汉大学SPF级动物房[实验单位使用许可证编号：SYXK(鄂)2015-0027]，室温20℃～23℃，人工光照12 h/d，相对湿度40%～60%，实验开始前适应性喂养1周，自由饮食。

1.2 主要试剂与仪器 咪喹莫特(上海TCI化工有限公司；批号：AMPWD-GF)；葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS；重均分子量:36 000～50 000；美国MP公司；批号：Q6182)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA；武汉楚诚正茂科技有限公司；批号：CC1050003)；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、硫脲、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、丙酮(国药集团化学试剂有限公司；批号分别为：10009617、30166428、10022318、J7427、10000418)；二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT；批号：428F0422)、Tris-HCl(北京索莱宝科技有限公司；批号：613V072)；尿素(美国Sigma公司；批号：BCBJ1471)；蛋白marker(美国Fermentas公司；批号：00611093)；iTRAQ-8标试剂盒(美国AB SCIEX公司；批号：4381663)；超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司；型号：JY92-11N)；台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司；型号：TGL-20M);真空冷冻干燥器仪(丹麦LaboGene公司；型号：SCAN SPEED 40);电泳仪、电泳槽(北京六一仪器厂；型号分别为：DYY-6C、DYCZ-24DN);酶标仪(上海永创医疗器械有限公司，型号：SM600);TripleTOFTM5600+质谱系统(美国AB SCIEX公司)；Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo DINOEX公司)

1.3 动物分组及模型制备 采用随机数字表法将30只小鼠分为正常组、模型组、咪喹莫特组，每组10只。除正常组饮用蒸馏水外，其余两组饮用3% DSS，连续饮用7 d，建立DSS诱导的小鼠急性UC模型。从造模第1天起，每日上午10：00分别给予正常组及模型组0.4 ml无菌磷酸缓冲盐溶液灌胃，咪喹莫特组给予0.4 ml咪喹莫特[30 mg/(kg·d)]灌胃，所有药品现配现用，连续治疗7 d。于实验第8天颈椎脱臼处死各组小鼠，在冰浴条件下取出结肠组织，放入液氮速冻后转入-80℃冰箱中备用。

1.4 iTRAQ技术定量分析蛋白

1.4.1 样品蛋白提取和定量测定：采用随机数字表法将每组10份结肠样本分成两组(即正常组1、正常组2、模型组1、模型组2、咪喹莫特组1、咪喹莫特组2)后进行混合，每小组取适量结肠组织用于提取蛋白；向样品中加入蛋白裂解液(7 mol/L尿素/2 mol/L硫脲/4% SDS/40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)/1 mmol/L PMSF/2 mmol/L EDTA)，加入终浓度为10 mmol/L的 DTT，冰浴超声15 min，然后13 000 r/min 4℃离心20 min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入4倍体积的冷丙酮，在-20℃静置过夜。4℃下12 000 r/min离心20 min，收集蛋白沉淀，空气中晾干。加入8 mol/L尿素/100 mmol/L三乙胺-碳酸缓冲溶液(pH 8.0)重新溶解蛋白，采用Bradford法[9]测定蛋白浓度。

1.4.2 蛋白酶解与标记：每个样品取等量的蛋白质用于胰蛋白酶消化酶解。酶解后的肽段用C18柱脱盐，根据iTRAQ-8标试剂盒说明书对真空冷冻干燥脱盐后的肽段进行标记，其中正常组1、正常组2、模型组1、模型组2、咪喹莫特组1、咪喹莫特组2分别标记为115、116、117、118、119、121，样本标记后混合。

1.4.3 蛋白分离与鉴定：将混合后的肽段运用Ultimate 3000型高效液相色谱仪对肽段样品进行分级分离，共收集42个次级馏分并合并成12个组分，合并后的组分在Strata-X柱上脱盐并真空干燥。质谱数据采集使用TripleTOFTM5600+质谱系统。

1.5 生物信息学分析 使用质谱系统配套的ProteinPilotV4.5软件进行蛋白质鉴定，以差异倍数≥1.5(上调)或≤0.67(下调)，且P≤0.05为标准筛选差异表达蛋白。采用BLAST2go(https://www.blast2go.com/)软件进行蛋白质的基因本体论(gene ontology，GO)功能注释，分别对细胞组分、分子功能和生物过程进行分析。

2 结 果

2.1 3组小鼠的一般情况 模型组小鼠出现明显腹泻、黏液脓血便、体重减轻等表现，提示DSS成功诱发急性UC。咪喹莫特组小鼠以上症状减轻，提示咪喹莫特能有效改善DSS诱导的UC症状。

2.2 小鼠结肠组织中的差异表达蛋白 运用iTRAQ技术联合液相色谱串联质谱蛋白质组学技术，共鉴定到4 170个蛋白，其中模型组/正常组、咪喹莫特组/正常组、咪喹莫特组/模型组相对定量到的蛋白质种数分别为4 019种、4 033种和4 030种。在相对定量结果中，模型组/正常组、咪喹莫特组/正常组、咪喹莫特组/模型组分别存在317个、253个和209个差异表达蛋白，见表1。模型组和正常组相比表达上调，而咪喹莫特组与模型组相比下调的蛋白有62个，见表2；模型组与正常组相比表达下调，而咪喹莫特组与模型组相比表达上调的蛋白有48个，见表3。

表1 两两样品间差异表达蛋白数量(个)

表2 模型组与正常组相比表达上调而咪喹莫特组

续表2

表3 模型组与正常组相比下调而咪喹莫特组与模型组相比上调的蛋白及其差异倍数

2.3 蛋白质的生物信息学分析 对表2及表3中的差异蛋白进行GO分析。这些差异蛋白主要分布在细胞器、细胞及胞外区，分子功能以结合功能、催化功能、结构分子功能及酶调节活性为主，主要参与细胞进程、生物调节及代谢过程，见表4。

表4 差异蛋白的GO功能

3 讨 论

UC是一种病因尚不明确的慢性非特异性炎症性肠病。在过去几十年中，UC的发病率在发达国家稳定增长，在发展中国家急剧增长，这种高发病率和流行性主要表现在欧美国家，可能与西方的生活环境和方式(药物使用、高糖高脂饮食、环境污染、生活压力等)有关[9-10]。虽然新的药物和治疗方法不断出现，但疗效并不显著。咪喹莫特是一种小分子免疫调节剂，具有抗病毒和抗肿瘤的作用[11]。有学者报告，咪喹莫特作为一种TLR7激动剂能够缓解小鼠的结肠炎[12-13]，本课题组前期研究结果也显示咪喹莫特对UC小鼠具有治疗作用。我们以前期研究为基础，采用iTRAQ技术分析咪喹莫特治疗UC小鼠前后差异蛋白的表达情况，结果显示模型组/正常组、咪喹莫特组/正常组、咪喹莫特组/模型组分别存在 317、253和209个差异表达的蛋白；其中模型组和正常组相比上调而咪喹莫特组与模型组相比下调的蛋白有62个，模型组与正常组相比下调而咪喹莫特组与模型组相比上调的蛋白有48个；生物信息学分析结果显示这些差异表达的蛋白主要分布在细胞及胞外区，以结合催化调节功能为主，参与细胞进程、生物调节及代谢过程。以下就几个典型差异表达的蛋白质做相关描述。

S100钙结合蛋白A8(即S100A8)属于钙结合蛋白S100蛋白家族成员，是重要的促炎细胞因子，主要在炎症和免疫过程中发挥作用，常与S100A9蛋白通过Ca2+依赖的方式形成S100A8/A9异二聚体共同发挥生物学作用[14]。生物信息学分析结果显示，S100A8主要定位在细胞质、细胞膜和细胞骨架，介导调节免疫和生物学功能。有学者认为S100A8能刺激人中性粒细胞向炎症部位迁移与黏附以及其他促炎活性[14]。目前，S100A8 已被作为一种炎症反应的生物标记物，用以监测疾病状态以及评估治疗效果[15]。其促炎活性的机制可能是机体免疫复合物可以刺激中性粒细胞分泌S100A8/A9，通过与晚期糖基化终末产物和TLR4结合，诱导细胞内丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB信号通路分泌白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α等细胞因子从而产生一系列的炎症反应[16]。另外，S100A8/A9还可以促进MAPK和核因子-κB信号通路的激活，以及结肠炎相关性癌症中肿瘤细胞的增殖[17]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠组织S100A8钙结合蛋白表达上调，而与模型组比较，经咪喹莫特治疗后的小鼠结肠组织S100A8钙结合蛋白表达下调，提示S100A8有助于UC的临床诊断，而降低结肠组织中的S100A8可能是咪喹莫特治疗UC机制之一。

肠黏液屏障防御机能失调是UC发病机制中的关键因素之一。黏蛋白2(mucin 2，MUC2)是肠黏液层主要成分，主要由杯状细胞分泌，它在调节黏膜免疫方面起着重要作用[18]。研究表明UC患者结肠黏液层厚度与正常人相比明显变薄，肠黏膜通透性增高，细菌穿透黏液层侵袭上皮细胞引起肠黏膜损伤[19]，而黏膜损伤又会影响杯状细胞分化和MUC2的表达，两者相互作用导致疾病的发生和发展。生物信息学分析结果显示，MUC2主要位于胞外区，参与机体的代谢和生物调节过程。有学者指出MUC2基因敲除小鼠(MUC2-/-)可以出现自发性结肠炎，出现明显的隐窝破坏，隐窝脓肿，炎症细胞浸润及黏膜下水肿，提示MUC2具有保护肠黏膜的作用[20]。Tadesse等[21]认为MUC2-/-小鼠在肠上皮细胞中的中间代谢途径发生改变，包括改变脂质代谢，提高葡萄糖利用率等，这些改变可以使肠道稳态失衡导致结肠炎症产生，严重者甚至可以发展成结直肠癌。目前，MUC2在肠道黏膜屏障损伤中的具体作用机制及意义尚未完全阐明。本研究结果显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的MUC2表达下调，而与模型组比较，咪喹莫特治疗后的小鼠结肠组织中MUC2表达上调，与既往研究[20]结论相似，提示咪喹莫特可能是通过增加黏膜屏障保护因子来修复受损黏膜从而起到治疗作用。

本研究结果显示，与正常组比较，角蛋白家族蛋白Krt7、Krt8、Krt18、Krt19、Krt20在模型组小鼠结肠组织中表达水平均下调，而与模型组比较，咪喹莫特治疗后的小鼠结肠组织中以上蛋白表达均上调。生物信息学分析结果显示，这些蛋白主要参与细胞骨架的形成。肠道中的角蛋白除了参与细胞骨架作用外还有其他重要功能。研究表明，Krt8、Krt18、Krt19通过多种方式与MAPK和P53通路存在相互作用关系，Krt8还对Fas介导的细胞凋亡具有重要作用，而这些通路都与UC的发生发展密切相关[22-23]。此外，Owens等[24]发现在细胞分化时，Krt8骨架的重建可能使肠黏膜上皮细胞易脆，肠道黏膜屏障功能受损，进而导致UC的发生。这均说明角蛋白在介导细胞信号转导及分化中具有重要作用。

综上所述，S100钙结合蛋白A8、黏蛋白2、角蛋白等有可能成为咪喹莫特治疗UC的重要分子靶点。应用iTRAQ蛋白组学技术可以全面快速地了解咪喹莫特治疗UC的作用机制，但本实验仅为初步研究，所筛选出的一系列差异蛋白的具体功能及作用机制仍需进一步验证。