李丽娜 ， 郭慧玲 ， 任彩霞 ， 张和平 *

（1.内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学，奶制品加工农业部重点实验室，内蒙古 呼和浩特010018）

乳酸菌是一类能够利用可发酵糖产生50%以上乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。广泛地存在于自然界、动植物体、乳制品及发酵食品中，其中多为非致病菌且具有降血压、改善肠道菌群、降低血液胆固醇等诸多益生功效[1]。在现代医学中，抗生素是防御细菌感染的主要手段。虽然大多数乳酸菌被公认为是安全的食用型菌种，广泛的应用于食品和药品等领域中。但因过度使用和滥用抗生素，致使一些乳酸菌出现抗生素耐药性，乳酸菌如果通过某种方式获得耐药基因，耐药基因可以与人群、动物、生态系统中的细菌互相传递，致使出现耐药致病菌，一旦将耐药性传递给人类，将会对继续使用抗生素来治疗细菌性疾病造成一定的威胁[2]。世界卫生组织（WHO）确定抗生素耐药性已经成为21世纪主要的健康性问题之一[3]。早期对细菌耐药性的研究主要集中在病原微生物上[4-5]，而近年来乳酸菌耐药性的研究逐步成为人们关注的焦点。

乳杆菌属是乳酸菌类群中最大的一个属，在肠道正常微生物体系中有着不可或缺的地位，它能够通过重组肠道菌群平衡来使人类及某些动物宿主恢复并达到健康状态[6]。保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）又称为德氏乳杆菌保加利亚亚种（lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）， 具有抗癌抗肿瘤、提高机体免疫力、促进胃肠道蠕动等益生功能[7]。乳酸菌的耐药性主要包括两种:固有耐药性和获得耐药性。固有耐药性是其本身所具有的特性，一般不会发生转移，所以不必考虑其安全性，获得性耐药性是由基因突变或通过外源而获得的耐药基因。保加利亚乳杆菌是乳杆菌属在食品工业中常用的菌种之一，所以有必要在使用前对菌株的表型及基因型进行分析以确保其安全性。

本实验首先通过标准化的肉汤稀释法来测定分离自蒙古国传统发酵乳制品中5株保加利亚乳杆菌对15种抗生素的耐药性，同时利用PCR技术来检测菌株中可能携带的耐药基因，以便于为以后菌种的选育及安全性评价提供重要的数据支持。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本实验选取的5株保加利亚乳杆菌IMAU20289、IMAU20360、IMAU20427、IMAU20514、IMAU20635全部由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室菌种保藏库提供。所有菌株通过16S rDNA序列分析均已鉴定。根据ISO10932/IDF223标准，37℃培养的乳杆菌选取Lactobacillus paracasei ATCC334做质控菌[8]，是为了能够更好的控制药敏实验的准确度和精确度。

1.2 培养基与试剂

LSM培养基（包含体积分数90%的ISO-SENSITEST和体积分数 10%的 MRS Broth）、MRS合成培养基（OXOID，CM0359）。

实验用抗生素:卡那霉素 （KAN）、利奈唑胺（LINE），购买于 Chembase公司；奎奴普丁/达福普汀（QVI/DAL），购买于Bioaustralis公司，庆大霉素（GEN）、链霉素（STR）、新霉素（NEO）、四环素（TET）、红霉素（ERY）、克林霉素（CLI）、氯霉素（CHL）、氨苄西林（AMP）、万古霉素（VAN）、甲氧苄啶（VAN）、利福平（RIF）和环丙沙星（CIP），均购于 Sigma-Aldrich 公司。

试剂:1 g/dL琼脂糖凝胶、5×TBE电泳缓冲液贮液、TE 缓冲液、10 g/dL SDS、0.5 mol/L EDTA、5 mol/L NaCl、3 mol/L NaAc、异丙醇、氯仿-异戊醇（24∶1，体积比）、酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，体积比）、dNTP、rTap 酶、蛋白酶 K、10×PCR Buffer、核酸染料等，以上实验试剂均购买于北京全是金生物工程有限公司及天根化学试剂公司，本实验所用的引物由上海桑尼生物科技有限公司设计并合成。

1.3 仪器与设备

试验所用仪器与设备见表1。

表1 仪器与设备Table 1 Instrument and equipment

1.4 实验方法

1.4.1 菌株耐药性表型分析

1）菌株的活化与菌液的制备。将保藏于冻存管中的菌以体积分数1%的接种量接种于MRS液体培养基中进行活化，37℃，培养24 h。后在MRS固体培养基上划线，37℃下培养48 h，挑取平板上单菌落于灭好菌的5 mL生理盐水中，直至OD625值在0.16~0.2[8]之间（活菌数约为 3×108CFU/mL），用培养基稀释500倍和900倍后制成种子液备用。

2）抗生素的制备。每种抗生素均用表2中的溶剂进行溶解，滤菌器过滤，于-80℃冰箱中保存，备用。用LSM稀释剂将水溶性和水不溶性抗生素溶液连续稀释至目标质量浓度的2倍和10倍。不同抗生素所需的溶解试剂及质量浓度测定范围如表2所示。

表2 不同抗生素的质量浓度测定范围及所需溶剂Table 2 Solvents and range of concentration for different antibiotics

3）菌株MIC的测定。最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）是指完全抑制菌株生长时的最小抗生素质量浓度[9]。本实验采用肉汤稀释法测定菌株的MIC值，具体的操作步骤参照ISO10932/IDF223[8]标准。

4）乳酸菌耐药性评价。将测定的MIC值与表3进行比较，基于EFSA颁布的标准[10]，如果MIC小于或等于临界值时定义为敏感（S），MIC大于临界值时定义为耐药（R），MIC临界值的评定标准是由欧盟食品安全局[10]（EFSA）和欧盟委员会[11]共同制定的。

表3 保加利亚乳杆菌对15种抗生素耐药性的评定标准Table 3 Evaluation criteria for the resistance of Lactobacillus bulgaricus against 15 antibiotics（μg/mL）

1.4.2 菌株耐药性基因型分析

1）菌株DNA的提取。利用CTAB液氮冻融法[12]提取所试菌株基因组的DNA。

2）菌株DNA纯度的检测。取2 μL的DNA用微量紫外分光光度计测其质量浓度及OD260/280值，为了做后续聚合酶链式反应的模板测定的OD值应在1.8~2.0间。

3）菌株耐药基因的检测。将上一步骤提取的基因组DNA作为模板，50 μL的反应体系如下:DNA模板2 μL、10×PCR Buffer 5 μL（含 Mg2+）、dNTP 4 μL、rTap酶 0.5 μL、Primer F 、Primer R 各 1.5 μL、 去离子水35.5 μL。 PCR扩增程序为:预变性94℃5 min、30个循环:变性94℃1 min、退火1 min、延伸72℃2 min，末端延伸72℃10 min。但不同引物具有不同的退火温度，实验中聚合酶链式反应中具体所用的引物序列、目的片段长度及退火温度见参考文献[13]。

PCR反应结束后，将 PCR产物与 6×DNA Loading Buffer以1∶1体积比的比例均匀混合后，加样于1 g/dL琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，并用凝胶成像仪对胶体进行分析，如果有条带出现且PCR产物片段长度大小与已知目的片段长度相同则证明菌株中含有耐药基因，如果无条带出现则证明菌株中不含有耐药基因。

2 结果与分析

2.1 菌株耐药性的表型分析

依据表3保加利亚乳杆菌对抗生素的评定标准可知，5株保加利亚乳杆菌对15种不同抗生素的MIC值测定结果如表4所示。

表4 5株保加利亚乳杆菌对15种抗生素的MIC测定结果Table 4 MIC determination results of 15 antibiotics for 5 Lactobacillus bulgaricus （μg/mL）

由表4可知，对于不同的抗生素5株菌均表现为不同的药物敏感性。相较于其他抗生素，对环丙沙星的耐药率最高。5株菌全部对利奈唑胺、氨苄西林、克林霉素、利福平、奎奴普丁/达福普汀、甲氧苄啶及万古霉素敏感，其中对万古霉素和甲氧苄啶的敏感性十分稳定，MIC值相同且均为＜0.25 μg/mL和16 μg/mL。对四环素、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、链霉素、新霉素、红霉素的敏感性次之。特别的菌株IMAU20360对卡那霉素、链霉素、红霉素均耐药且卡那霉素（＞1 024 μg/mL）、链霉素（128 μg/mL）和红霉素（8 μg/mL）的MIC值均达到了所检测质量浓度范围的最高值。

D'Aimmo[14]研究了乳杆菌对常见的不同抗生素的耐药性，结果显示所有菌株对青霉素、红霉素、氨苄西林、利福平及克林霉素等抗生素敏感，对多粘菌素B和卡那霉素等耐药，对链霉素、氯霉素、万古霉素、四环素、新霉素和庆大霉素不同菌株分别表现出不同程度的耐药性。先前的研究同样也表明乳杆菌对氨苄西林和红霉素具有高度敏感性[15]。黄晓敏[16]利用琼脂稀释法测定了57株保加利亚乳杆菌的MIC值，其中对克林霉素的耐药率为0，对红霉素、青霉素、阿莫西林的耐药率约为3.5%~12.3%之间，对四环素、庆大霉素的耐药率为21.1%~26.3%。周宁[17]的测定结果显示保加利亚乳杆菌对氨基糖苷类抗生素例如:庆大霉素、卡那霉素、链霉素完全耐药，且属于固有耐药性，而对大环内酯类抗生素中的红霉素完全敏感。Li等[18]对19株乳酸菌的耐药性研究表明对环丙沙星的耐药率高达68.4%，据相关研究报道因为DNA旋转酶上gyrA基因上的A亚基，环丙沙星通过作用于A亚基从而抑制DNA的合成和复制，最终致使细菌死亡。本实验与D'Aimmo、黄晓敏、周宁、Li的研究结果基本一致，但也存在个别差异，例如我们观察到菌株IMAU20360对糖肽类、大环内酯类、苯丙醇类抗生素耐药，且在氨基糖苷类抗生素中对庆大霉素的耐药程度较弱，可能与庆大霉素能通过细胞膜相关，该结果与周宁等人研究的结果不一致。此外我们还发现菌株IMAU20514对四环素耐药，该发现与黄晓敏报道中的结果也存在差异。这种同种不同菌株间的差异可能是因为多药转运蛋白或存在缺陷细胞壁自溶系统等非特异性机制所引起的[19]。因vanX基因能够编码D-ala-D-ala二肽酶易使万古霉素不能与细菌结合，所以通常认为乳杆菌对糖肽类抗生素万古霉素为固有耐药性[20]。但也有人认为这并不代表是物种的固有特性，因为在德氏保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、约氏乳杆菌中可能存在可变性[21]。本研究发现所有的菌株对万古霉素完全敏感，此结果也充分证明了保加利亚乳杆菌对万古霉素并非是固有耐药性。

2.2 菌株耐药性的基因型分析

根据耐药性分析结果，本实验利用PCR技术对5株保加利亚乳杆菌的耐药基因进行了检测，检测结果如表5所示。

表5 5株保加利亚乳杆菌中耐药基因的检测结果Table 5 Determination of antimicrobial resistance genes from 5 Lactobacillus bulgaricus

由表5所示，根据特异性引物利用PCR技术扩增后发现5株菌中均携带耐药基因，共检出erm（B）、vanX 、aac（6'）-aph（2''）、parC、rpoB 5 种不同的耐药基因，其中erm（B）、vanX存在于每株菌中。本研究中，菌株的耐药表型与其基因型呈对应关系，如菌株IMAU20360对庆大霉素和红霉素耐药，且相对应的基因型检测结果发现其携带庆大霉素耐药基因 aac（6'）-aph（2''）和红霉素耐药基因 erm（B）。在于涛[22]的研究中也在保加利亚乳杆菌中检测到了庆大霉素耐药基因 aac（6'）-aph（2''），与本实验研究结果一致。 aac（6'）-aph（2''）能够编码双功能修饰酶 AAC（6'）-APH（2''），该酶具有磷酸转移酶和乙酰基转移酶两种活性，属于氨基糖苷类钝化酶之一，同时影响了大部分氨基糖苷类抗生素使其具有较高的耐药性[23]。秦宇轩等[24]在对红霉素敏感的菌株中却检测到了红霉素耐药基因erm（B），此结果说明敏感的菌株中可能存在耐药基因。同样的本研究也在 敏 感 菌 株 IMAU20289、IMAU20427、IMAU20514及IMAU20635中均检测到了红霉素耐药基因erm（B）和万古霉素耐药基因vanX，在菌株IMAU20360和菌株IMAU20514中分别检测到针对环丙沙星的耐药基因parC和对利福平的耐药基因rpoB，在RNA的水平上这可能是因为该耐药基因并未表达，或是因为调控基因表达的核苷酸序列发生了基因突变最终使开放阅读框不被表达[25]。值得注意的是本研究从3株耐环丙沙星的菌株中均未发现相对应的耐药基因，在对卡那霉素、四环素、新霉素、链霉素及氯霉素表现为耐药的菌株中并未检测到与其表型相对应的耐药基因。Toomey等[26]发现在一些表型对链霉素存在耐药性的菌株中并未检测到如strA，strB、aadA和aadE等已知的链霉素的耐药基因。这充分表明了耐药基因的检出与耐药性之间并不存在直接关系，耐药菌株可能由其他相关耐药基因调控或存在其他的耐药机制，然而这些存在的耐药机制，相关的耐药基因是否会转移到不同种属的细菌甚至是致病菌中则需要进一步的深入研究。

3 结语

本实验对蒙古国传统发酵乳制品中5株保加利亚乳杆菌的耐药性进行了初步研究。结果表明，保加利亚乳杆菌对大多数的抗生素敏感，仅有菌株IMAU20360对庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、红霉素及氯霉素表现为耐药，菌株IMAU20289、IMAU20514、IMAU20635对环丙沙星耐药。本实验中耐药表型与基因型存在一定的差异。所有菌株中共检测到了5种不同的耐药基因，在对红霉素和万古霉素敏感的菌株中均检测到了erm（B）和vanX的存在，且在部分耐药菌株中并未检测到与其表型相对应的耐药基因。本实验说明了乳酸菌可能会是耐药基因的潜在贮存库，这些耐药基因潜在的转移性可能会造成一定的食品安全隐患。所以有必要加强对乳酸菌的安全性评价并完善乳酸菌安全性评价体系，尤其是对在工业中常用的菌株，在使用前确保其安全性，为其在药品、食品等应用中的安全性提供理论基础。