张多强，辛国军

（西北民族大学第一附属医院（宁夏回族自治区人民医院）肝胆外科，银川 750002）

枸 杞 多 糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞子的提取物，具有多种生物活性作用[1]及抗肿瘤功能[2]，并能诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制其增殖[3]。有研究报道，枸杞多糖在肝癌中也具有抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡作用[4]，但其对肝癌细胞迁移侵袭的影响尚未清楚。肿瘤血管的形成是肿瘤生长、转移及肿瘤细胞吸取营养的基础，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肿瘤血管生成中发挥关键作用[5]。VEGF在肝癌组织中呈显著高表达[6]，VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞HepG2的迁移和侵袭的能力[7]。有研究发现，枸杞多糖可使肝癌细胞中VEGF蛋白的表达下降[8]，但VEGF在肝癌细胞中的表达及其与肝癌细胞迁移侵袭的关系尚不明确。本研究拟以肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，检测枸杞多糖处理的SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭，观察沉默VEGF和过表达VEGF对SMMC-7721细胞迁移、侵袭的影响，明确枸杞多糖抑制SMMC-7721细胞迁移侵袭的机制是否与负调控VEGF有关，为枸杞多糖治疗癌症提供依据。

材料与方法

1 材料

人肝癌细胞SMMC-7721购自ATCC; DMEM培养基、胎牛血清、MTT试剂、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；pcDNA 3.1载体、LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；Transwell小室、基质胶购自美国Coming公司；SDS-PAGE 试剂盒、ECL发光液购自碧云天生物技术公司；兔抗人多克隆抗体MMP-2、兔抗人多克隆抗体MMP-9、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗均购自美国Santa Cruz 公司；兔抗人多克隆抗体VEGF 购自碧云天公司；PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司；Gel Doc XR+凝胶成像分析系统购自美国伯乐；枸杞多糖购自宁夏银川市药材公司；si-VEGF、si-NC均由上海吉玛公司合成。

2 细胞培养

用含有10%胎牛血清DMEM培养液培养人肝癌细胞SMMC-7721，置于37℃,5% CO2的培养箱中常规培养。

3 细胞转染与枸杞多糖处理

按照脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书要求操作将si-VEGF、si-NC、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-VEGF转染SMMC-7721细胞，标记为si-VEGF组、si-NC组、LBP+pcDNA 3.1组、LBP+pcDNA 3.1-VEGF组，转染6 h后更换培养基继续培养48 h，检测转染效率。转染成功后，培养至对数生长期。

枸杞多糖处理：将SMMC-7721细胞调整密度至106个/ml，培养24h后，用枸杞多糖（0、100、200、400μg/ml）处理48 h，然后用于后续试验。

4 MTT分析

取适量细胞，加入20μl 5g/ L的MTT溶液，培养4h，然后弃去上清，每孔加入150μl DMSO，震荡使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度（A）。细胞增殖抑制率 =1-AOD490样品/AOD490对照×100%。

5 Transwell分析

将细胞以106个/孔接种于细胞6孔板，培养至融合度75% 时，更换无血清培养基培养过夜。调整细胞密度至105个/ml，取 100μl 加入上室内，600μl含血清的培养基加入下室，培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS洗涤，甲醇固定30min，0.1%结晶紫染色20min，PBS洗涤。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞数，随机选5个视野计数，取平均值。

将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

6 Western blot

收集细胞，加入裂解液，冰上裂解30min。12000r/min离心10min。取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加二抗，4℃孵育2h。漂洗后用ECL试剂盒进行显影曝光：滴加化学发光剂进行显影，采用凝胶成像系统采集图像。Quantity One 4.62图像分析软件进行条带灰度值分析，以β-actin为内参，以目的条带与βactin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

7 qRT-PCR分析

取适量材料方法3中的上述各组细胞，按RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA，进行定量。再将cDNA转移至19℃室温下，按逆转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。最后严格按qRT-PCR试剂盒说明书操作步骤进行VEGF mRNA检测，5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′（上游引物），和5′-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3′（下游引物）；用2-△△Ct计算VEGF mRNA的表达。

8 统计学处理

实验中所有数据均采用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差（¯x±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 枸杞多糖抑制肝癌细胞增殖

运用MTT法检测不同浓度LBP（0、100、200、400μg/ml）处理对肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖的影响。结果显示，LBP处理SMMC-7721细胞48h能剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞的增殖，其中100μg/ml LBP 的抑制率为 (4.49±1.34)%，100μg/ml LBP的抑制率达到(54.79±4.48)%（表1）。为了消除由于增殖抑制对实验的干扰，选用抑制率在10%左右的浓度（100μg/ml） 作为迁移和侵袭实验的药物作用浓度 。

2 枸杞多糖抑制肝癌细胞迁移和侵袭

用Transwell法检测显示，100μg/ml LBP处理48h能显著SMMC-7721细胞的迁移和侵袭（图1，表2）。

表1不同浓度LBP对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用Tab. 1 Inhibition effect of different concentrations of LBP on human liver cancer cell line SMMC-7721

图1 Transwell分析检测LBP对肝癌细胞迁移率和侵袭力的影响。比例尺，100µmFig. 1 Transwell assay for detection of the effect of LBP on migration and invasion of hepatoma cells. Scale bar, 100µm

表2 LBP对肝癌细胞迁移和侵袭影响的统计学分析Tab. 2 Statistical analysis for effect of LBP on migration and invasion of hepatoma cells

3 枸杞多糖抑制肝癌细胞中迁移和侵袭相关基因的表达

Western blot和qRT-PCR检测显示，100μg/ml LBP处理SMMC-7721细胞48h可显著下调MMP-2和MMP-9蛋白及其mRNA表达（图2，表3）。

4 枸杞多糖下调SMMC-7721细胞VEGF表达

Western blot和qRT-PCR检测显示，100μg/ml LBP处理SMMC-7721细胞48h可显著下调VEGF蛋白及其mRNA表达（图3，表4）。

图2 枸杞多糖（100μg/ml）对SMMC-7721细胞MMP-2、MMP-9表达影响的Western blot检测Fig. 2 Western blotting detection for effect of LBP (100μg/ml) on expression of MMP-2 and MMP-9 in the SMMC-7721 cells

表3 LBP对SMMC-7721 细胞中MMP-2和MMP-9蛋白与mRNA表达影响的统计学分析Tab. 3 Statistical analysis for the effect of LBP on protein and mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in the SMMC-7721 cells

表4 LBP对SMMC-7721 细胞中VEGF蛋白与mRNA表达影响的统计学分析Tab. 4 Statistical analysis for the effect of LBP on protein and mRNA expression of VEGF in the SMMC-7721 cells

5 沉默VEGF的SMMC-7721细胞MMP-2和MMP-9水平下调迁移侵袭力降低

Western blot分析显示，转染si-VEGF的SMMC-7721细胞中VEGF显著降低，同时，细胞迁移和侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9水平也显著下调（图4，表5）；Transwell分析发现，转染si-VEGF的SMMC-7721细胞的迁移力和侵袭力均显著降低（表5）。

表5 沉默VEGF对SMMC-7721细胞MMP-2/MMP-9水平和迁移率侵袭力影响的统计学分析Tab. 5 Statistical analysis for effect of silencing VEGF on the levels of MMP-2//MMP-9 in and the ability of migration and invasion in the SMMC-7721 cells

图4 沉默VEGF对SMMC-7721细胞MMP-2和MMP-水平影响的Western blot检测Fig. 4 Western blotting detection for the effect of silencing VEGF on the levels of MMP-2 and MMP-9 in the SMMC-7721 cells

6 过表达VEGF逆转枸杞多糖对SMMC-7721细胞迁移侵袭力的抑制

应用Transwell实验分析显示，通过转染pcDNA3.1-VEGF在SMMC-7721细胞过表达VEGF后 （图5），LBP抑制SMMC-7721细胞迁移率和侵袭力的作用明显减弱（表6）。

图5 SMMC-7721细胞中转染过表达VEGF的Western blot检测Fig. 5 Western blot detection for the efficiency of transfection with overexpressed VEGF in the SMMC-7721 cells

表6 过表达VEGF对 LBP抑制SMMC-7721细胞迁移侵袭作用影响的统计学分析Tab. 6 Statistical analysis for the effect of overexpression of VEGF on the inhibition of migration and invasion of SMMC-7721 cells by LBP

讨 论

枸杞多糖是构象呈高度支化状的杂多糖，其主要药理成分为当归多糖，具有抗肿瘤、抗辐射、补血、免疫调节等作用[9]，可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，对各种类型的癌细胞具有抗肿瘤活性，如可抑制裸鼠肿瘤生长[10-12]。早在2005年Zhang等[13]报道，LBP处理引起QGY7703细胞生长受抑制，S期循环停滞和凋亡诱导，且细胞中RNA的量和细胞内Ca2+的浓度增加，提示细胞周期停滞和凋亡系统中细胞内钙的增加可能参与QPY7703细胞中LBP的抗增殖活性。几年后，Zhang等[14]又发现，枸杞多糖LBP-a8、LBP-a3、LBP-a1和LBP-a4均能够以浓度和时间依赖的方式抑制SMMC-7721细胞增殖。李梅林等[15]发现，枸杞多糖及枸杞硒多糖均可抑制肝癌细胞HepG2的增殖，但其作用机制尚未清楚，预测其在食品保健、医药中具有很大潜力。本研究运用MTT、Transwell检测枸杞多糖处理的肝癌细胞SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭发现，枸杞多糖可呈浓度依赖性增加对SMMC-7721细胞增殖的抑制，以及抑制SMMC-7721细胞的迁移和侵袭；进一步深入研究检测肝癌细胞中迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达发现，SMMC-7721细胞中MMP-2、MMP-9的表达下调。

血管内皮生长因子（VEGF）在癌症中的作用并不局限于血管生成和血管通透性，也为肿瘤起始的重要组成部分，可能与癌症的转移密切相关[16-18]。Tian等[19]发现，枸杞多糖和丹参素能够降低兔血管增生性视网膜病变过程中VEGF含量，提示通过改善缺氧环境或影响各种新生长因子，可以预防视网膜微血管病变的发生。Lin等[20]报道，新型抗VEGF人源化单克隆抗体BD0801对体外抑制HepG2、SMMC-7721和Bel7402细胞的增殖，同时诱导G1期细胞凋亡和细胞周期停滞，在体内可抑制小鼠肿瘤异种移植物的生长并诱导HepG2和SMMC-7721肿瘤异种移植物的细胞凋亡，其机制与降低AKT、Erk1/2和Rb磷酸化和细胞周期蛋白D1有关，表明BD0801是一种有效的抗VEGF单克隆抗体，可用于治疗HCC。本研究检测了枸杞多糖处理的肝癌细胞SMMC-7721中VEGF的表达发现，VEGF表达明显下调，与Tian的研究结果一致。进一步研究发现，沉默VEGF可降低SMMC-7721细胞的迁移和侵袭并下调迁移侵袭相关基因MMP-2、MMP-9的表达；过表达VEGF可逆转枸杞多糖对肝癌细胞迁移、侵袭的抑制作用。因此，枸杞多糖抑制肝癌细胞的迁移和侵袭与其下调VEGF有关。这些结果为肝癌的VEGF靶向治疗提供了重要依据。